[发明专利]用于扩增反应的分析工具

说明书

技术领域

本发明涉及借助于聚合酶链式反应(PCR)的核酸定量的领域。

背景技术

核酸的定量在从分子生物学和遗传研究到诊断和病原体检测的许多领域中是重要的。当存在足够量的核酸时，可以应用斑点(blot)技术用于定量。然而，这些技术的有限灵敏度妨碍了它们在许多情况中的使用。

不久前发展起来的定量PCR方法提供了在要求高得多的灵敏度情况下用于分析的工具。这些技术是基于以下事实：在PCR扩增期间产物的量以指数方式增长，并且因此，可以通过常规手段（例如，荧光检测）来检测在少量循环之后所获得的产物的量。另外，原则上，如果已知扩增循环的数目，则可以从扩增结束时获得的产物的量来确定初始（即，在扩增开始时）存在的产物的量。

在扩增反应进程上形成的PCR产物的典型曲线图揭露了扩增过程的四个不同阶段（见图1）：(1)基底阶段(GP)，其中荧光信号由背景荧光和噪声主导；(2)指数阶段（EP），其中来自PCR产物的信号上升超过基底水平并以指数形式增加；(3)对数线性阶段（LP），其中由于由诸如PCR试剂消耗和检测探针退化之类的因素引起的减小的扩增效率，信号以小于指数速率增加；(4)由于扩增反应的渐增的放缓和最终的停止而具有该信号的余量上升的平稳阶段（PP）。

然而目前没有可用的物理模型以逼真的形式描述在PCR过程期间被检测到的信号的发展。因此，当前的用于核酸定量的方法要求执行校准步骤，该校准步骤涉及对具有已知浓度的标准/或比较的核酸序列的参照样品执行同样的PCR反应。很多时候，用作标准的核酸序列是公知的看家基因(housekeeping gene)。简要地概述，在实践中，靶核酸序列以及标准和/或比较的样品在确定的反应条件下进行PCR，并且也称为扩增子的PCR产物的形成在扩增过程的进程上受到监控。例如，借助于荧光标记的杂交探针或借助于检测双链PCR产物的DNA插入荧光染料来实现PCR产物的检测。确定了为获得特定荧光阈值水平所需的扩增循环的数目，其被指定为C_t值，并将靶的C_t值与具有已知浓度稀释系列的核酸标准的样品的C_t值比较（绝对定量）。为确定靶的绝对量，根据标准样品的C_t值构建标准曲线并将该标准曲线用于确定靶的初始浓度。可替换地，将靶的C_t值与关心的单个比较核酸的C_t值比较（相对定量）。在该情况下，靶和比较样品的C_t值的比值被确定并用于评估靶和比较核酸序列的初始量的比值。

总体而言，核酸定量新方法的发展面临许多挑战，其中的某些挑战源于将在以下更详细地讨论的若干应用要求完全自动化的事实，并且其中的某些挑战与校准过程相关。

采用C_t值确定的用于核酸定量方法所要求的校准过程引入了许多潜在的限制。首先，标准样品的检查要求另外的实验努力和资源。其次，这些方法是基于标准和靶样品内的扩增效率相同的假设。重要的是，该假设通常是不正确的并因此提供了不准确的来源。

定量的PCR领域中的另外挑战与在短时间间隔内分析大量样品的增长的需求相关。由于定量PCR的日益增长的应用范围要求以高通量方式分析数量非常大的样品，例如在临床实践中，就需要发展能够完全自动化且需要非常少或无需人机交互的定量的PCR方法。这在某些情况下是至关重要的，因为如果要求人机交互，高通量应用（例如在临床实践中）就不能简单地在所要求的短时间段内进行。

使用这种自动化方法能够实现的另外的优点将是目前使用迥异的定量PCR实验室协议的不同实验室之间的分析数据改进的可比性。考虑到越来越多的实验室使用定量PCR技术用于基础研究，该问题具有至高的重要性。建立自动化方法作为定量实验的客观参照将通过增强实验室间的一致性而使这些研究努力极大地受益。