[发明专利]杀虫基因的AXMI-192家族和使用它们的方法

说明书

相关申请的交互参考

本申请要求2009年7月31日提交的美国临时专利申请系列号61/230,659的权益，所述专利申请的内容均通过引用方式完整并入本文作为参考。

参考电子提交的序列表

通过EFS-Web将序列表的正式文本电子提交为2010年7月27日创建的具有文件名“APA067US01_SEQLIST.txt”的ASCII格式序列表，并且其具有273千字节的大小且与本说明书同时提交。在该ASCII格式文件中包含的序列表是本说明书的一部分并将其通过引用方式完整并入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀虫制剂中并且在产生转基因抗害虫植物中有用。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它产生晶状包涵体的能力，其中所述的晶状包涵体特异性地对某些目和种的昆虫有毒，但是对植物和其他非靶向的生物无害。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫性蛋白质的组合物可以作为环境可接受的杀虫剂用来控制农业害虫或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(Δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、双翅目的和鞘翅目的幼虫的强力杀昆虫活性。这些蛋白质也显示针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫类以及其他无脊椎动物类如线虫类动物(Nemathelminthe)、扁形虫(Platyhelminthe)和Sarcomastigorphora的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.在Advanced Engineered Pesticides中，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白质起初主要基于它们的杀昆虫活性分类为CryI至CryV。主要类型是鳞翅目特异的(I)、鳞翅目与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)和线虫特异的(V)与(VI)。所述蛋白质进一步划分成亚家族；每个家族内部更高度相关的蛋白质被给予区分性字母如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个部分内部甚至更密切相关的蛋白质给予名称，如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶特异性，最近描述了Cry基因的一种新命名法(Crickmore等人，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在这种新分类中，每种毒素赋予一个独特名称，包含初阶(阿拉伯数字)、次阶(大写字母)、三阶(小写字母)和四阶(另一个阿拉伯数字)。在这个新分类法中，罗马数字已经更换为初阶中的阿拉伯数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的初阶，并且次阶和三阶的标准分别是78％和95％。

晶体蛋白在昆虫中肠中被摄取和溶解之前不显示杀昆虫活性。所摄取的前毒素(protoxin)由昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。这种毒素与靶幼虫中肠中的顶部刷状缘受体结合并插入顶膜，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

Δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人，(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“簿卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，见上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。