[发明专利]在连续细胞培养中产生所关心多肽或病毒的方法

说明书

对相关申请的交叉参考

本申请要求2009年7月31日提交的美国临时申请第61/230,313号的权益，并要求其优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及在哺乳动物细胞培养物中产生所关心多肽或病毒的连续细胞培养策略。本文所述的连续细胞培养策略合并了恒化器和灌流培养技术的优点。

背景技术

产生所关心多肽或病毒的能力对于生物技术工业日益重要。过去二十年，生物技术的进步引起了对许多多肽和病毒的关注，这些多肽和病毒具有作为疫苗和医药的潜在治疗用途。大规模生产一般涉及例如在细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞或其它细胞类型中重组产生所述所关心多肽或病毒。具体来说，在哺乳动物细胞培养物中产生所关心多肽或病毒优于在细菌或其它低级微生物宿主中的产生，原因在于哺乳动物细胞能够对复杂的蛋白质结构进行翻译后加工，例如经由依赖于二硫键的折叠和糖基化作用。

哺乳动物细胞在体外一般以两种模式繁殖：作为非锚定依赖性细胞，在培养物的整个本体中自由悬浮生长；或作为锚定依赖性细胞，需要粘附到供其繁殖的固体基质(即，单层类型的细胞生长)。已经开发出微载体系统来容纳两种类型的生长。例如，锚定依赖性细胞可以在包含小固体颗粒的微载体系统中繁殖，所述小固体颗粒利用缓慢搅动悬浮于生长培养基中。该系统允许锚定依赖性细胞粘附到悬浮颗粒的表面，并生长到汇合，而同时微载体保持悬浮于生长培养基中。或者，可以使用大孔微载体从而在生物反应器中含有非锚定依赖性细胞，例如利用细胞到这些微载体的表面的非特定粘附。非锚定依赖性细胞或锚定依赖性细胞的微载体悬浮培养是大规模生产细胞和细胞产物的最广泛使用的方式。

大规模悬浮培养可以在封闭系统中操作，例如作为分批式(batch)或流加式(fed-batch)封闭系统，封闭系统比开放系统更方便操作和放大。通常，在封闭系统中，没有细胞、产物和/或废物除去(尽管可能利用通风来加入空气(例如氧气)和除去CO₂)。在分批式生长系统情况下可见的典型生长曲线涉及迟缓期，后面为指数期、稳定期和衰亡期。在这些分批式系统中，随着养分耗尽和代谢物积聚，环境连续发生变化。在流加式系统中，关键养分被连续送入系统中从而延长生长周期，尽管细胞、产物、副产物和废物(包括毒性代谢物)未除去。因此，利用分批式或流加式系统来产生所关心多肽或病毒受到细胞和有害物质诸如毒性代谢物的积聚的限制。

大规模悬浮培养也可以在开放系统中操作，例如在灌流系统或恒化器系统中。在灌流系统中，使新鲜培养基灌流穿过培养物，同时利用各种细胞截留装置截留细胞。细胞截留装置的类型包括例如微载体、微孔旋转过滤器、中空纤维、平板膜过滤器、沉降管、超声波细胞截留装置等。通常，灌流培养物设计成增加细胞密度到最大值，而细胞截留装置设计和操作成具有＞90％的细胞截留率。这些培养物通常达到＞2X10⁷的细胞密度，这必须利用稀释率大于约2.0d^-1的细胞培养基进料来供应。然而，由于生物质不受控制的增加，使得系统很难保持稳态，并且难以控制和/或达到一致的生产条件。

恒化器系统利用培养基连续流入与细胞和产物的流出来操作。在恒化器系统中，没有细胞截留装置，以致生物反应器中细胞的浓度和从生物反应器收获的上清液中细胞的浓度大致相同。通常，培养基以预定的恒定速率送入反应器，从而保持培养物的低稀释率(通常为0.3d^-1至0.8d^-1)。为防止细胞冲坏，稀释率一般选择为小于、有时等于细胞的最大比生长率。含有细胞、细胞产物、副产物、废物等的培养流体同时除去，或大致同时除去。恒化器系统通常提供高的控制程度，因为培养物可以在比生长率等于稀释率下平衡，即，达到稳态。此平衡决定了细胞、代谢物、废物、表达产物(例如，分泌蛋白)等的浓度。由于至少一种限制性基质，恒化器系统中的比生长率通常低于最大生长率。不过，在一些系统中，稳态可以通过控制和调整生物质而保持在最大比生长率，例如在恒化器培养的turbidstat系统中。优选地，这些恒化器培养物含有在整个生物反应器中均匀分布的细胞(例如，单细胞悬浮液)。但是，与灌流系统相比，恒化器系统通常产生较低的细胞密度。此外，恒化器系统的固有缺点在于，细胞的进料不能够独立于生物反应器系统中的细胞密度来进行控制。