[发明专利]糖基化相关的材料和方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖基化相关的材料和方法，其更具体地说涉及糖基化结构的生产，所述结构耐受酶促降解，因而调节其一个或多个生物特性或整合它们的治疗部分的生物特性。更具体地说，本发明涉及使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)与糖接受体(sugar acceptor)反应以产生糖接受体与一种或多种所述唾液酸化合物的共价缀合物。

背景技术

多数天然多肽含有糖部分，所述部分在一级多肽链的一些氨基酸残基处共价连接至所述多肽。在本领域中，这些多肽一般称为糖肽或糖蛋白。还已知，当多肽存在于生物系统(例如，细胞或个体)时，任何给定多肽上的糖基化模式的性质可影响其特性，所述特性包括蛋白酶抗性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期和抗原性。

多肽的糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。在自然界中，通过酶促的过程引入糖基化，导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰。在N-连接的糖基化中，聚糖被连接至天冬酰胺侧链的酰胺氮，而在O-连接的糖基化中，聚糖连接至丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧。其他形式的糖基化包括糖胺聚糖(其连接至丝氨酸的羟基氧)、糖脂(其中聚糖连接至神经酰胺)、透明质烷(其不连接至蛋白或脂质)和GPI锚(其通过聚糖连接将蛋白连接至脂质)。

本领域中的普遍问题是糖基化通常加至真核细胞中的多肽，但很少加至经常用于治疗性多肽重组表达的原核宿主中所表达的多肽。原核宿主中产生的多肽中糖基化的缺乏可导致所述多肽被识别为外源物，或者意味着其具有其他不同于其天然形式的特性。还有一个问题是，在试图在没有天然糖基化的位置将糖基化改造进入多肽来调节肽特征时，发现其非常困难。

因此，例如在多肽的表达可引起多肽的天然糖基化形式改变(例如，在细菌宿主中表达)或需要修饰多肽的糖基化形式以改进所述多肽的一个或多个特征(尤其是当所述多肽是治疗性蛋白时)的情况下，本领域中一直在尝试引入或修饰多肽的糖基化形式。例如，参见US专利No：7226903中描述的干扰素β的修饰。

连接至多肽的聚糖分子具有一系列直链和支链结构和不同长度的聚糖链，并且多肽上存在的特定聚糖分子影响所述多肽的特征。很多类型的聚糖分子包括末端唾液酸。这些在生理pH下带负电荷的9个碳原子的糖被认为参与配体-受体相互作用，所述相互作用可极大地影响特定的细胞-细胞、病原体-细胞或药物-细胞的通讯。包含末端唾液酸残基的聚糖链的一个特别的特征是其增加以所述唾液酸糖基化的治疗性多肽的半衰期。通过这样的观察而得知：包含无末端唾液酸残基的聚糖被肝从循环中迅速地除去，因而降低治疗性多肽的半衰期。

氟取代的糖已被用作不可加工的底物用于结晶酶，例如CstII(Chiu等，Nat.Struct.Mol.Biol.(2004)11，163-170)。在这种情况下，在含氟糖的糖苷连接处，含氟的糖已知对酶促加工有抗性。

2，3-二氟唾液酸衍生物已被合成，并且用作来自寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(Watts等，J.Am.Chem.Soc.(2003)125，7532-7533)和让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)(Watts等，Can.J.Chem.(2004)82，1581-1588)之唾液酸酶的灭活剂。该前期工作导致发现这些唾液酸酶通过共价的唾液酸基酶中间体的参与而运作，并且确立例如该衍生物的化合物作为锥虫唾液酸酶的时间依赖性的共价灭活剂而发挥作用。

随后，还已知在C-5具有羟基(而非天然的N-乙酰基基团)的2，3-二氟神经氨酸衍生物也作为让氏锥虫(T.rangeli)唾液酸酶的共价灭活剂而发挥作用，但显示出对原抑制剂(Watts等，J.Biol.Chem.(2006)281，4149-4155)非常不同的动力学行为(k_非活性和k_反应性)。

总之，多肽糖苷的修饰(尤其是对其生物特性的修饰)仍然是本领域中具有挑战性的问题和尚未被以满意的方式解决的问题。

发明概述