[发明专利]与RNA对应的双链DNA的合成方法以及扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种与特定RNA对应的双链DNA的合成方法以及对该DNA进行扩增的方法。

背景技术

目前，进行RNA基因分析时，为获得全长的cDNA，经研究得到的方法包括SMART法、Oligo-Capping法、Cap Trapper法等。但是，无论何种方法，如果不是具有polyA和Cap结构的RNA，存在着无法获得全长的cDNA，无法分析不包含Cap结构的RNA片段等的问题。另一方面，作为能够分析RNA片段的方法，人们熟知的有微阵列法，由于该方法需要高价的仪器，因此并不是容易用于实验阶段的方法。

因此，人们期待开发一种对即使不具有Cap结构的RNA片段也能进行基因分析的、操作简便且价格低廉的能够用于基因分析的新方法。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种价格低廉且操作简便，由特定RNA来合成与其对应的双链DNA的方法以及扩增该双链DNA的方法。

解决问题的技术手段

鉴于上述情况，本发明的发明人注意到：现在许多cDNA已建立数据库，即使不对全长的cDNA，而只要能够对部分片段进行分析的话，就能够从数据库中将cDNA确定出来，由此对获得RNA的cDNA片段的方法以及利用了该cDNA片段的RNA基因分析进行了切实研究。其结果发现，以mRNA、源自mRNA片段等具有polyA的RNA为模板，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物，合成第1链后，在不具有3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用添加有衔接子的随机引物，从第1链合成第2链，由此，能够价格低廉且操作简便地获得与具有polyA的RNA相对应的cDNA片段，进而完成本发明。

本发明涉及“含有与具有polyA的RNA相对应的碱基序列的双链DNA的合成方法，其特征在于包括，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的寡聚(dT)引物，对具有polyA的模板RNA进行逆转录反应，得到单链DNA的工序1；以及，在不具有3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段的随机引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的工序2。”和“含有与具有polyA的模板RNA相对应的碱基序列的双链DNA的扩增方法，其特征在于包括，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-1)的寡聚(dT)引物，对具有polyA的RNA进行逆转录反应，得到单链的工序1；在不具有3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性的聚合酶的存在下，使用5’末端添加已知序列的DNA片段(衔接子-2)的寡聚(dT)引物，将工序1中得到的单链DNA进行双链化反应，得到双链DNA的公序2；以及，利用3’末端含有衔接子-1碱基序列的引物1和3’末端含有衔接子-2碱基序列的引物2，以工序2中得到的双链DNA为模板，进行PCR反应的工序3”。

发明效果

根据本发明的方法，尽管具有polyA的模板RNA是序列未知的RNA，但是，能够获得含有对应(互补的)碱基序列的双链DNA。即，本发明的方法能够获得用现有的方法难以获得的、不具有Cap结构的RNA片段所对应的双链DNA。此外，该法无需使用微阵列法那样昂贵的仪器就能够获得与具有polyA的RNA相对应的双链DNA。因此，根据本发明的方法，能够操作简便且价格低廉地进行RNA的基因分析。具体地说，通过对由本发明的方法获得的双链DNA的序列进行分析，并与公知的基因数据库进行比较，就能够操作简便且价格低廉地鉴定模板RNA。

进一步，根据本发明的扩增方法，尽管具有polyA的RNA是微量的，但也能够得到克隆可能的量的DNA。此外，由于得到的双链DNA的链长不依赖于具有polyA的RNA的链长，所以相对于样品中的总RNA在维持具有polyA的RNA的存有比率的情况下，就能够进行扩增，并能够应用于RNA的定量分析。

附图简要说明

图1为本发明示例所示的双链DNA扩增方法的模式图。

图2为对由实施例1的6.的菌落PCR得到的同一克隆的3种菌落的插入片段，进行电泳后的凝胶成像照片。