[发明专利]生产蜘蛛丝蛋白聚合物的方法

说明书

发明技术领域

本发明涉及蛋白质重组生产的领域，更具体地涉及蜘蛛丝蛋白(蛛丝蛋白(spidroin))的重组生产。本发明提供了生产分离的蜘蛛丝蛋白的聚合物的方法。还提供了新的蜘蛛丝蛋白以及用于生产这种蛋白质及其聚合物的方法和多核酸分子。

发明背景

蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的结合，获得非凡的韧性和延伸性。蜘蛛具有多至七种的不同腺体，其产生多种具有不同机械特性和功能的丝类型。由主壶腹腺(major ampullate gland)产生的拖丝(dragline silk)是韧性最大的纤维，并且以重量为基础时，其优于人造材料，如抗拉钢(tensile steel)。拖丝的所述特性在用于医疗或技术目的的新材料的研发中是具有吸引力的。

拖丝由两种主要的多肽组成，通常称为主壶腹蛛丝蛋白(MaSp)1和2，但在十字圆蛛(Araneus diadematus)中称为例如ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200-720kDa范围内的分子量。编码黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)的拖丝蛋白的基因是唯一已经完全表征的基因，并且MaSp1和MaSp2基因分别编码3129和3779个氨基酸(Ayoub NA等，PloS ONE 2(6)：e514，2007)。Huemmerich，D.等，Curr.Biol.(当代生物学)14，2070-2074(2004)中讨论了拖丝多肽的性质。

蜘蛛拖丝蛋白或MaSp具有三部分的组成：非重复的N-端结构域、由许多重复的聚-Ala/Gly区段组成的中心重复区、和非重复的C-端结构域。通常认为重复区形成丝纤维中的分子间接触，而末端结构域的确切功能还不太清楚。还认为与纤维形成相关，重复区经历了从无规卷曲和α-螺旋构象至β-折叠结构的结构转变。蛛丝蛋白的C-端区在蜘蛛物种和丝类型之间通常是保守的。蜘蛛丝的N-端结构域是最保守的区域，但其功能尚未了解。Rising，A等，Biomacromolecules(生物大分子)7，3120-3124(2006)表征了Euprosthenops australis MaSp1基因的5’端，并且推导出相应的氨基酸序列。重组表达MaSp1蛋白的N-端结构域。

蜘蛛丝蛋白及其片段难以以可溶形式来重组产生。大部分之前的生产人造蜘蛛丝纤维的尝试包括在非生理溶剂中的增溶步骤。几种因素使得拖丝蛋白的表达变得复杂。由于基因的高重复性，以及伴随的蛋白质的受限的氨基酸组成，产生了转录和翻译错误。微生物表达系统中tRNA库的耗尽，和随后的不连续翻译，导致蛋白质合成的过早终止，可能是另一个原因。对蛋白合成切断讨论的其他原因是mRNA的二级结构形成和基因的重组。大于2.5kb的天然MaSp基因已经显示出在细菌宿主中是不稳定的。此外，维持可溶形式的重组丝蛋白存在困难，因为两种天然衍生的拖丝片段和设计的嵌段共聚物，尤其是MaSp1/ADF-4衍生的蛋白质，容易自我装配成无定形聚集物，引起蛋白质的沉淀和损耗。参见Huemmerich，D.等，Biochemistry(生物化学)43，13604-13612(2004)和Lazaris，A.等，Science(科学)295，472-476(2002)。

生产人造蜘蛛丝的尝试中已经使用了编码拖丝蛋白的天然或合成的基因片段。已经在包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物、昆虫细胞、转基因蚕和转基因山羊的各种系统中表达了重组拖丝蛋白。参见，例如，Lewis，R.V.等，Protein Expr.Purif.(蛋白表达和纯化)7，400-406(1996)；Fahnestock，S.R.& Irwin，S.L.Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)47，23-32(1997)；Arcidiacono，S.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)49，31-38(1998)；Fahnestock，S.R.& Bedzyk，L.A.Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)47，33-39(1997)；和Lazaris，A.等，Science(科学)295，472-476(2002)。