[发明专利]结构化肽加工

说明书

本发明涉及肽的加工，所述肽的结构因与化合物结合而受约束，所述化合物提供结构骨架，赋予所述肽构象。具体而言，本发明涉及这类肽的蛋白水解处理，以选择蛋白酶抗性肽或者选择所产生的切割产物。

介绍

对生物靶标有高亲和力和特异性的分子的制备是化学、生物和制药科学的中心问题。具体而言，结合配体对于可干预生物过程的药物的制备是重要的。与所选靶配体结合的配体的制备通常包括产生众多推定的结合分子和检测所述分子的结合性能的过程。

合成的分子结构所束缚的多肽在本领域中已知(Kemp，D.S.和McNamara，P.E.，J.Org.Chem，1985；Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。Meloen和同事们曾使用三(溴甲基)苯和相关分子进行将多个肽环快速和定量环化至合成支架上，以用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。制备候选药物化合物的方法在WO 2004/077062和WO 2006/078161中公开，其中通过将含半胱氨酸的多肽连接到分子支架(如例如三(溴甲基)苯)来制备所述化合物。

WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。具体而言，此文件公开了包含第一和第二活性基团的各种支架分子，并在偶联反应中用另一种分子接触所述支架以在所述支架和所述另一种分子之间形成至少两个键。

WO2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和肽模拟物。此文件公开了从现有的蛋白质中获得的肽的各个集合的人工合成。然后将这些肽与具有为了制备组合文库而引入的一些氨基酸变化的固定合成肽结合。通过经由化学键引入此多样性来分离以各种氨基酸变化为特征的肽，使获得所需结合活性的机会增加。此文件的图7显示各种环肽构建体的合成示意图。然而，所产生的肽有单特异性。在提供多个肽环的位置，所述环协同结合到单一靶标。

在我们共同待审的国际专利申请WO2009098450中，我们公开了将生物选择技术例如噬菌体展示用于选择合成的分子结构所束缚的肽。

在本领域中已知修饰多肽(包括多肽库)的蛋白水解处理的应用。例如，GB2428293(Domantis Limited)描述了以下方法，其通过用蛋白酶处理噬菌体来还原噬菌体上所展示肽的化合价，使得大多数噬菌体不展示肽和一部分是单价的。

基于噬菌体展示蛋白对蛋白水解降解的抗性而从该蛋白库中选择稳定折叠的蛋白质的策略，已用于改善天然蛋白质的稳定性。蛋白水解的降解通常限制于解折叠的蛋白质或折叠蛋白质的高度柔性区域。折叠的蛋白质大部分是蛋白酶抗性的，因为蛋白水解切割要求多肽链呈蛋白酶活性位点的特定立体化学，从而使蛋白酶活性位点有柔性、可接近和能够局部解折叠。

此外，本领域中已将蛋白酶用于制备所需切割产物，例如在Fc、Fab和Fv抗体片段的制备中。

我们发现，蛋白酶消化技术可适于修饰合成分子支架所束缚的结构化多肽，无论其是否在噬菌体上展示。这些技术不仅使蛋白酶抗性结构化肽的制备而且使蛋白酶切割产物的制备成为可能，在上述蛋白酶切割产物中大多数多肽仍然束缚于支架。

发明概述

在第一个实施方案中，提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤：

(a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于(subtend)两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；

(b)将所述肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和

(c)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体。

在相关的实施方案中，本发明提供制备一种或多种肽配体的方法，所述肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基上与分子支架共价连接的多肽，所述方法包括以下步骤：

(a)在遗传展示系统中展示一种或多种肽配体，其中所述多肽包含两个或更多个与分子支架形成共价键的活性基团和至少一个环，所述环包含位于两个所述活性基团之间的两个或更多个氨基酸的序列；

(b)针对靶标结合筛选所述肽配体，和选择与所述靶标结合的配体；

(c)将与所述靶标结合的肽配体暴露于一种或多种蛋白酶；和

(d)针对靶标结合进一步筛选所述肽配体。