[发明专利]测定去抑制后酶活性的方法和设备

说明书

本发明涉及测定去抑制后的酶活性，具体是测定蛋白水解酶，主要是测定在恶性肿瘤诊断和治疗中至关重要的半胱氨酸蛋白酶活性的方法和设备。

样品中存在酶与抑制物的复合物，在体内蛋白水解酶的活性主要通过与抑制物结合而受到抑制。类似的论题可参见WO97/00969中所述。

另外，德国专利申请10 2007 017 681.5涉及类似的发明，还有德国专利申请10 2007 057 388.1和10 2007 034 120.7，它们所公开的全部内容通过引用纳入本文。

根据现有技术，已知此类酶活性的测定主要受到样品中抑制物的抑制，酶活性的测定方法是，先使样品通过柱流穿，除去样品中抑制该酶的抑制物。然后，将无抑制物的酶加到检测容器中，加入合适的底物后，通过反应期间至少一种酶切产物浓度的提高来测定该酶的活性。

本专利申请的目的是提供测定去抑制后酶活性的方法和设备，实现了检测灵敏度的显著提高和更高的可靠性，这样就不再需要为获得生物样品而进行手术干预，因为现在可用血清替代生物样品。

另外，本发明提供的测定去抑制后酶活性的方法和设备，适合执业医师或小规模医学实验室的每日日常工作，或急诊病例，其操作相当简便，能提供足够准确的结果，特别是费用低而有效，可作为预后要素(决定疗法)或作为预后指标(诊断目的)。

采用权利要求1所述的测定去抑制后酶活性的方法和权利要求10所述的测定去抑制后酶活性的设备可实现该目的。

其它实施方式和其它添加内容出自从属权利要求。

为了测定去抑制后的酶活性，优选荧光底物其中7-氨基-4-甲基香豆素，作为荧光物质与寡肽，优选二肽的C-末端结合，其N-端用羧基苄基保护基团保护(缩写为Cbz或Z)。

然而，某些情况下，明确地说，测定结果不够准确。

C-末端用7-氨基-4-三氟甲基香豆素代替7-氨基-4-甲基香豆素，可使切下的荧光物质的发射光迁移到更长的波长，从而可在该波长范围内检测酶切下的荧光物质的荧光，而样品中其它要检测的发光物质不会再干扰其测定结果，从而实现灵敏度更高的酶活性检测，特别是用普通设备和方法时。

如果生物样品是(例如)组织样品或组织匀浆，采用旁路法，可检测样品通过旁路后样品中原先不受抑制的半胱氨酸蛋白酶的那部分酶活性。已知组织匀浆中要测定的是受抑制的蛋白酶而不是所有酶，这只是其中的一部分酶。因此，测定两次酶活性，即生物样品通过亲和层析柱后和通过旁路后两次测定值的差异，提供了生物样品中原先受抑制的酶活性。

本发明所测定的发射荧光的波长范围约为500nm至以上。

以下附图显示：

图1显示本发明第一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。

图2显示与图1设备相比功能改进的设备，它几乎是半自动化设备。

图3显示本发明另一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。

在图1和图2中，模块A为平面剖视图，模块B为立体图。

在附图描述中，对于相同或功能相同的部件采用相同的数字。

图1显示本发明第一个实施方式测定去抑制后酶活性所用的设备。

可替换亲和层析柱1包封在配备至少一个珀耳帖(Peltier)元件的恒温器2内。柱1是圆柱体，充填有多孔基质凝胶载体，该载体基质结合酶抑制物复合物中的抑制物比酶更牢固。因此，酶被释放，可测定其活性。可替换注射器4的尖端8可伸入柱1的上部开口3内，优选在柱1的下端安装关闭阀门6，注射器4内装入体积5含酶与抑制物复合物的样品。

当垂直推压注射器4时，体积5实际变为0，内含物进入装有载体(优选紧密装填)的柱1中。

然后用第二注射器7将体积为样品体积约100-103倍的洗脱缓冲液全部或部分加入柱1中。

第一种方法如下：取样品与一部分洗脱缓冲液一起在柱1中，于确定的适当温度(例如约4℃)下培育一段时间，具体约10-18分钟。15分钟特别有效。然后，用注射器7进一步加入洗脱缓冲液，洗脱游离的酶，当打开阀门6时，洗脱液向下流入图1的模块B中。

在第一种方法中，先打开阀门6直到一部分柱缓冲液进入柱1内，或直到样品分散到整个柱长内。此时，可不考虑计量排放(例如图2所述，通过排水管28)体积。培育后，打开阀门6进行洗脱，然后关闭阀门，残留体积不会损害测量值。该残留体积也可通过排水管28排放。