[实用新型]一种紫杉醇产生菌发酵红豆杉枝叶生产紫杉醇新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫杉醇产生菌株的分离选育方法和利用该菌株发酵红豆杉枝叶转化紫杉醇前体物，提高紫杉醇得率的工艺技术。

背景技术

紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，由红豆杉树干、树皮或针叶中提取或半合成的有效成分，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。通过II-III临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。由于其作用机制独特，对很多耐药病人有效，成为目前最热门的抗肿瘤药物之一。

红豆杉是一种生长缓慢的乔木，分布于北半球的温带至亚热带地区，我国有四种和一个变种(南方红豆杉)，但是全世界资源总量却极其有限，散生分布于天然林中。目前全世界的紫杉醇需求量在每年数十至数百吨紫杉醇纯品，寻求新的来源成为主要的研究方向。

1、从红豆杉的不同部位提取紫杉醇

主要通过红豆杉树皮提取生产紫杉醇，但是对野生资源破坏巨大，人们试图从红豆杉植株的其他部位提取以扩大紫杉醇来源，Kelth Witherup测定了6种红豆杉枝叶和茎中的紫杉醇含量，发现针叶中的紫杉醇含量较高。

2、良种繁育、人工栽培

为弥补天然资源的奇缺，国内外的工作人员进行红豆杉良种选育和扦插快繁技术研究，其中宾夕法尼亚大学国家天然产物技术中心已筛选出高紫杉醇含量的植株供人工栽培，美国农业部和密西西比大学联合栽培红豆杉规模达数百万株，3～5年即可收割。

3、化学合成紫杉醇

①全合成紫杉醇

美国佛罗里达州立大学的化学教授豪顿以樟脑为起始材料，采用线性合成法，于1993年12月完成紫杉醇全合成；Scipps研究所1992年报告先合成两个六元环，再将其连续形成以八元环为中心的中间体，然后再合成四元环，从而完成紫杉醇的全合成。但是两种全合成途径都包括25～30步的化学反应复杂过程，距工业化生产尚有很大距离。

②半合成紫杉醇

1988年，法国Denis首次报道了从欧洲红豆杉的针叶中获得10-乙酰浆果赤霉素III(baccatin-III)，以此为原料半合成了紫杉醇及其同系物texotere。随后美国Rhone-Poulene Rorer化学公司也实现了紫杉醇的半合成，并申请了以baccatin-III为原料半合成紫杉醇的专利。美国BMS公司计划在获得美国FDA批准后，停止从树皮中萃取紫杉醇的生产活动，利用半合成法进行工业化生产紫杉醇。

4、利用植物细胞工程方法生产紫杉醇

利用植物细胞培养法生产紫杉醇，该方法曾经一度是各种研究方向中十分有吸引力的一个方向，也是1990年美国NCI主持召开的紫杉醇研讨会上，得到NCI投资的方向之一，但是十年来没有突破性进展。

5、紫杉醇类似物

目前世界各国科学家从红豆杉属植物中分离得到200多种化合物，都具有紫杉烷三环二萜的基本骨架，部分具有抗肿瘤活性。

综合分析，目前国内外对紫杉醇的研究方向很多，但是没有成型的可进行工业化生产，主要原因为红豆杉资源不足，栽培的树种生长缓慢，不能短时间内提供足够原料；紫杉醇分子式结构复杂，很难进行化学合成的工业化生产，细胞培养方法由于发酵周期长且高产细胞株选育耗时长，中试投产都有一定困难。于是，国内外学者开始转向真菌发酵法生产紫杉醇，目前遇到的关键问题是紫杉醇产生菌的分离和发酵液中紫杉醇含量的提高成为技术瓶颈。

发明内容

为进行紫杉醇的工业化生产，本发明通过生产实践，研究出一种新型的紫杉醇生产工艺。包括以下步骤：

1、紫杉醇产生菌的选育：采用分离自南方红豆杉韧皮部的真菌，经过紫外线诱变，筛选出紫杉醇前体物转化活性强、增殖速度快的“WM20094001”号菌株作为生产菌株。

2、“WM20094001”号菌株斜面培养基配方为固体MS培养基，摇瓶培养基为液体MS培养基，发酵培养基为液体MS培养基。

3、紫杉醇生产菌发酵72h左右的发酵液用自行研制的营养液稀释5倍后，拌入经前处理的红豆杉枝叶，20℃～25℃条件下处理120h左右，转化紫杉醇前体物。

4、红豆杉枝叶处理采用热蒸汽瞬时表面脱蜡和消毒，平铺于发酵床上，采用通风发酵的方式进行发酵。

5、发酵后，机械搅拌成糊状，加入三倍体积95％乙醇，搅拌均匀，静置浸提30min，提取液经离心去渣，于40℃以下真空干燥，获得浸膏状产品。

本发明的创新体现在以下几个方面：