[发明专利]小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备抗肿瘤药物，尤其涉及具有抗肿瘤作用的小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物及其制备方法。

背景技术

利用抗体对肿瘤特异抗原的选择性，对抗肿瘤药物进行主动靶向设计，可提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，降低其对正常器官的毒性。目前，抗体药物的研究主要有两个方向：一个是抗体药物的小型化。由于抗体及其偶联物均为大分子物质。IgG型抗体的分子质量约为150kD，庞大的抗体或偶联物分子难以通过毛细管内皮层和细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化抗体药物对提高疗效有重要意义。通过酶切方法获得的Fab片段，其分子质量约相当于完整抗体的1/3。研究表明，抗体片段较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞。与完整抗体相比，抗体片段的免疫原性较弱。使用抗体片段，可降低人体的抗体反应。另一个研究方向就是抗体药物的高效化。抗体连接上对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的“弹头”，可降低药物的用量及对其他器官的毒性，还可以减少治疗费用。

早在本世纪70年代初，美国哈佛大学Judah Folkman博士就正式提出：肿瘤的发生、发展和转移都与肿瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)密切相关，因此靶向肿瘤血管生成的治疗策略就显得尤为重要。研究表明，Endoglin高表达于各种肿瘤组织及肿瘤组织边缘血管起源的内皮细胞，但很少出现在正常组织的内皮细胞，是肿瘤血管生成的标志性分子之一，可作为肿瘤抗血管治疗和靶向治疗的重要靶点。阿霉素(Adriamycin，ADM)是一种抗肿瘤抗生素，可严重干扰DNA的合成、DNA依赖性RNA合成和蛋白质合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。本文将初步探讨小型化的Endoglin抗体片段与阿霉素偶联物的抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种具有抗肿瘤作用的小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物，该偶联物Fab-ADM不但有更强的肿瘤抑制效果，还可显著延长荷瘤动物的生存时间。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：提供小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物，其中，偶联物Fab-ADM是由N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)作为交联剂，MBS首先与一含有-NH2的分子即阿霉素(ADM)反应并稳定结合为活性的中间产物，然后再与一含有-S-的分子即为经胃蛋白酶消化、二硫苏糖醇(DTT)还原的抗体片段Fab反应得到终产物，即偶联物Fab-ADM；Fab与ADM的分子比为1∶2。

本发明还提供小型化Endoglin抗体与阿霉素偶联物的制备方法：包括以下步骤：

(1)、选用MBS作为交联剂备用；

(2)、阿霉素的MBS修饰：

阿霉素的MBS修饰：调整阿霉素浓度为10mg/ml，MBS浓度为2mg/ml，以MBS与阿霉素摩尔比为10∶1调整反映体系，于室温反应30min后，立即与巯基化的单抗混合。

(3)、Endoglin抗体片段Fab的巯基化

经饱和硫酸铵沉淀及丙烯葡聚糖凝胶S-200HR(Sephacryl S-200HR)纯化得到的单抗分子，与胃蛋白酶反应时的分子比约为20∶1，37℃，反应3-6小时，反应体系pH值为4.5；反应结束后，加入2M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0终止反应；调整经Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化所得的F(ab′)2浓度为10mg/ml，加入二硫苏糖醇(DTT)还原，其终浓度为50mM，室温反应30min，脱盐后立即与步骤(2)中的MBS修饰的阿霉素偶联。

(4)、偶联物的制备

MBS修饰的阿霉素与巯基化单抗的摩尔比为约15∶1，室温反应18h；偶联物过Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化并超滤浓缩，于吸光度280nm处测定蛋白浓度。

附图说明

图1为偶联物的制备原理图；其中A：MBS反应原理图(引自Bioconjugate Techniques(2nd Edition)，Greg T.Hermanson，P287)；B：阿霉素；C：经胃蛋白酶消化、DTT还原所得的抗体片段Fab；D：抗体经胃蛋白酶消化示意图(来自Internet：http://www.binglixue.com/zhikao/yaodian/jichu/my05.htm)；

图2为MTT法分析游离ADM与偶联物Fab-ADM对肝癌细胞株BEL-7402的体外增值抑制率；