[发明专利]一种毛囊干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毛囊干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞生物学研究的开展与进步，大大促进了人们对于发育过程中许多基础生物学问题的理解，同时也带给人们一种全新的疾病治疗思路——干细胞移植。对于大面积皮肤烧(烫)伤和皮肤病治疗来说，干细胞移植具有长远的应用前景。表皮干细胞移植最早在1991年就已经用于临床，然而，其形成的皮肤不具有皮脂腺和毛囊，所以在功能上来说是不全的。

皮肤是哺乳动物自身与外部环境的屏障，具有抵御微生物感染、保持水分、调节体温、感觉、吸收、分泌与排泄等生理功能。毛囊是皮肤的附属物，其结构包括外根鞘、内根鞘、真皮乳头、皮脂腺和毛干等，目前认为毛囊干细胞存在于外根鞘的特定部位：隆突部。毛囊干细胞是皮肤中已知细胞类型中多潜能性较强的干细胞，小鼠体内实验证明，它能形成完整的表皮、皮脂腺和毛囊。

毛囊干细胞是成体干细胞的一种。相对胚胎干细胞和目前新兴起的诱导多能性干细胞来说，由于哺乳动物几乎所有体表都覆盖有毛囊，毛囊干细胞更容易从自身获得，不受伦理因素的制约，避免了异体干细胞移植带来的免疫排斥，因此具有很大的临床应用前景与价值。

毛囊干细胞移植首先要解决的问题就是如何获得足量毛囊干细胞。传统的毛囊干细胞分离方法主要是基于流式细胞仪的分选方法，例如2003年Trempus CS等最早用α6整合素抗体和CD34抗体分选出了小鼠毛囊干细胞，2006年Ohyama M等用多种抗体的组合分选出人毛囊干细胞。但是这种基于流式细胞仪分选的方法有很大的缺点，即需要大量皮肤用于制备单细胞悬液，这对于大面积皮肤损伤(烧伤或烫伤等)的患者来说是不可能的。此外，分选过程中，单个细胞在体外时间长，处于悬浮状态，细胞容易发生凋亡，细胞经过流式细胞仪时容易受到机械损伤，这些都导致分选到的毛囊干细胞不易成活，克隆形成效率极低。

如何利用尽可能少的皮肤组织高效获得足量的毛囊干细胞用于干细胞移植，是当前亟待解决的难题。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种毛囊干细胞的分离培养方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供的毛囊干细胞的分离培养方法，是利用器官培养的方法，采用William’s E完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞。

优选地，所述方法中所采用的William’s E完全培养基为在William’s E基本培养基中添加以下成分：10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，5.8毫摩尔/升的L-谷酰胺，0.115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素；更优选地，所述William’s E完全培养基中还包括体积百分含量为15％的胎牛血清。

优选地，所述培养毛囊的条件如下：37℃、5％CO₂和100％湿度。

优选地，所述方法还包括采用消化液纯化通过器官培养法获得的毛囊干细胞的步骤；优选地，所述消化液为含有质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液；优选地，所述纯化步骤如下：在室温下(20～30℃，优选为25℃左右)，用消化液消化从毛囊长出的细胞(包括毛囊干细胞以及成纤维细胞等杂细胞，消化液覆盖细胞即可，大约消化3-5分钟，如果需要获得极高纯度的毛囊干细胞，可以适当延长消化时间)后，成纤维细胞等杂细胞脱落，用磷酸缓冲液洗掉成纤维细胞，再加入消化液，于37℃下继续消化3-5分钟，用磷酸缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞，1000转/分钟离心5分钟后，传代或冻存。

优选地，所述方法还包括传代和增殖纯化的毛囊干细胞的步骤；优选地，所述传代和增殖的条件如下：William’s E完全培养基，37℃、5％CO₂、100％湿度，2-3天更换一次培养液。

优选地，所述方法还包括鉴定所制备的毛囊干细胞的步骤；更优选地，所述鉴定方法选自细胞形态结构鉴定、mRNA水平鉴定和蛋白质水平鉴定。

优选地，所述方法中的毛囊来自哺乳动物皮肤；更优选地，所述毛囊来自哺乳动物触须，优选为大鼠触须。

本发明还提供了上述方法所制备出的毛囊干细胞。