[发明专利]三唑仑检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层技术制作的一种三唑仑检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

三唑仑又名海乐神、酣乐欣，淡蓝色片，是一种强烈的麻醉药品，口服后可以迅速使人昏迷晕倒，故俗称迷药、蒙汗药、迷魂药。可以伴随酒精类共同服用，也可溶于水及各种饮料中。见效迅速，药效比普通安定强45-100倍。三唑仑是当前国内最常用的苯二氮卓类药物之一，常被犯罪分子用于麻醉抢劫和麻醉凶杀。据报道，三唑仑在体内吸收代谢快，其主要代谢产物是α-羟基三唑仑。由于三唑仑剂量少，在生物检材中的三唑仑及其代谢产物含量均很低，因此对其提取检验困难。

有关三唑仑的检测方法有很多，例如：高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等方法，这些方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但是存在需要昂贵的仪器设备，对检测材料的要求高，需要提纯处理等限制。因此研究具有快速、便携等优点的检测方法具有现实意义。本发明介绍了一种以胶体金免疫层析法快速检测三唑仑的检测试剂盒及其制备方法，该方法具有简单、快速，无需任何仪器设备，经济实用等特点，适用于快速定性检测样本中是否含有三唑仑。

胶体金免疫层析技术是20世纪九十年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。基于胶体金免疫层析技术可以制备胶体金试纸，胶体金试纸的原理是应用胶体金标记技术，以胶体金为示踪物，利用抗原抗体特异性结合反应，利用特定的显色反应在试纸上的显色而判定检测的结果，具有操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性强，无须复杂的仪器等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快捷、灵敏度高、特异性强的三唑仑试剂盒及其制备方法，用于检测待检样本中是否含有三唑仑。

一种用于检测三唑仑的检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的三唑仑单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了三唑仑-牛血清蛋白偶联抗原，质控线(C线)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述吸样垫为吸水纸。

本发明采用纳米胶体金技术及抗原抗体特异性反应，应用免疫竞争抑制反应的原理制备而成，通过待检样本中含有的三唑仑与硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被的三唑仑-牛血清蛋白偶联抗原竞争结合胶体金标记的三唑仑单克隆抗体，通过T线的显色来判定待检样本中是否含有三唑仑。

本发明提供了一种三唑仑检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备三唑仑偶联抗原

将三唑仑与牛血清蛋白偶联，合成三唑仑-牛血清蛋白偶联抗原，作为三唑仑偶联抗原。

(2)制备三唑仑单克隆抗体

采用三唑仑-牛血清蛋白偶联抗原为免疫原免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗三唑仑单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得三唑仑单克隆抗体。

(3)制备胶体金

取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。

(4)制备胶体金垫

取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至7.0-9.0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入三唑仑单克隆抗体，使三唑仑单克隆抗体的浓度为10-60μg/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；加入10％的牛血清蛋白(BSA)溶液使其浓度为10-60μl/ml，混合均匀，室温放置30分钟；12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解；12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用30％-100％初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到三唑仑单克隆抗体-胶体金标记物；将三唑仑单克隆抗体-胶体金标记物按1mL铺40-70cm2聚酯膜的比例均匀铺在聚酯膜上，再置干燥间，在温度38℃，湿度小于30％的条件下干燥24±2小时，制成胶体金垫。

上述胶体金复溶液为含0.01-0.1％的Tris，1.0-3.0％的蔗糖、0.1-1.0％的BSA的0.02M pH7.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液。