[发明专利]一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

烷基酚类化合物（Alkyl Phenol，APs），属于内分泌干扰物质中重要的一种，具有明显的环境雌激素效应。该类化合物多为脂溶性有机化合物，化学稳定性较强，一旦摄入就不易降解排出，有生物累积性，危害性较大，即使微量也可对生物产生影响。同时其在环境中分布也十分广泛，并且含量较低。烷基酚类化合物APs是重要的精细化工原料，在表面活性剂、润滑油添加剂、油溶性酚醛树脂及绝缘材料、纺织印染、造纸助剂、农药乳化剂、工业用洗涤剂、橡胶塑料的防老抗氧剂、油田及炼油厂化学品等领域具有广泛用途。APs中最重要的是壬基酚(Nonyl Phenol，NP)和辛基酚(Octyphenol，OP)，二者只在长碳链相差一个甲基，它们同属于联合国UNEP制订的持久性有毒化学污染物。NP和OP等APs内分泌干扰物主要为烷基酚聚环氧乙烷醚(Alkylphenolethoxylater，APEO)在环境降解过程中的中间产物。一般随着APEO的排放进入环境，并且在环境中分布比较广泛。APs类化合物可以对生物体形成外因性雌性激素作用，其中又以OP为最强，NP次之，而其它APs类化合物则依照亲水端链从短到长，作用程度依次削减。APs类化合物是促乳房癌细胞活性化与增殖现象的环境内分泌干扰物。同时烷基酚类化合物对细胞的DNA有明显的损伤作用，并且DNA的损伤程度与化学结构有一定的关系，苯酚环中增加其他基团，可使致突变活性增强，并且随着苯酚环中氯原子数的增加，致突变活性也增强；随着苯酚对位碳原子数增多，其致突变活性也增高等。因此，APs类物质也逐步被列入强制性禁用范围，一些国家纷纷制定法规限制APs的生产和使用。欧盟第2003／53／EC号指令规定纺织品中NP和NPEO含量均不能高于0.1％。这些措施成为我国纺织品出口欧盟面临的又一大技术贸易壁垒，因此对APs检测方法的研究提上日程。现今烷基酚主要的分析方法有：高效液相色谱法、气相色谱法、LC-MS、LC-MS/MS 、GC/MS等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没有针对烷基酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以烷基酚的降解产物壬基酚NP为半抗原的用于烷基酚类结构检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于烷基酚类结构的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了更好的必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法，以壬基酚为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比。步骤为：

（1）人工抗原的合成：壬基酚、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺、牛血清白蛋白控制摩尔比为80︰120︰136︰1的比例反应，壬基酚溶液溶于含二甲基吡啶的戊二酸酐的无水乙醇和吡啶混合溶液中，65℃搅拌反应24h后用真空旋转蒸发提纯，再加N,N-二甲基甲酰胺DMF溶剂溶解后，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和碳二亚胺搅拌反应6h，为A液；牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，为B液；将A液逐滴加入B液中，室温下搅拌反应3h，离心取上清液得壬基酚-BSA混合液，即为烷基酚类药物通用人工抗原混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0.01M的PBS溶液透析2次，再用每次2L的去离子水透析2次，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得壬基酚-BSA偶联物，即是烷基酚类药物通用人工抗原；

（2）人工抗原的鉴定：壬基酚-BSA偶联物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其偶联比。