[发明专利]一种制备酶标记抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种酶标记抗体的制备方法。

背景技术

酶免疫测定技术自问世以来发展迅速，在药物筛选、医疗诊断、食品安全检测等众多领域得到广泛应用。它既继承了放射性免疫测定的高灵敏度等优点，又克服了前者需使用放射性标记这一缺点。酶免疫测定将酶促反应的高效率和免疫反应的高特异性有机地结合起来，可对各种分析物如蛋白、毒素、农药、微生物等进行定量检测，是目前灵敏度高、适应性强、并在生产和临床中得到推广的免疫测定技术。另外，在免疫测定中使用酶作为标记，还在于酶能保持长期的稳定性、对操作人员无危害、并避免了放射性免疫中存在的废物处理问题。而制备特定抗体和酶偶联物（酶标记抗体）是能否实现对特定抗原分析物进行定量检测的关键。

目前用于酶标记抗体制备的方法传统的主要有戊二醛法和过碘酸钠法。戊二醛法也是至今最常见的标记酶到抗体上的偶联方法。它又分为一步法和两步法，一步法操作简便、快速，只要将一定量的酶和抗体加入到缓冲液中，同时加入一定量的戊二醛进行反应。但一步法的缺点是（1）偶联反应不易控制，若被偶联的两种物质与偶联剂的反应速度不同，则反应速度快的那种分子易发生自生聚合；（2）偶联效率不高，参与偶联反应的两种分子所占比率较低。而两步法克服了一步法的缺点，它采用将与偶联剂反应较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去除多余偶联剂后再加入反应速度相对快的偶联分子。两步法虽然操作繁琐，但偶联率提高，而且形成的同分子聚合物减少。过碘酸钠法是偶联酶和糖蛋白产率最高的方法，该法利用过碘酸钠将糖蛋白（抗体、糖基化的酶等）上的糖链基团氧化成醛基，再通过醛基与待偶联的分子发生连接。与戊二醛法相比，过碘酸钠法的效率提高至少3～4倍。用于偶联HRP和IgG时，约有70%的酶和99%的抗体反应。最佳时，每个IgG分子可与5～6个HRP分子连接。尽管按该法制备酶标记物时酶活的损失可达50%，但用于酶免疫测定时可将灵敏度提高5倍左右。过碘酸钠法虽有很高的产率，但操作中对于过碘酸钠的浓度和工作pH等都需十分注意，过碘酸钠浓度过高可以导致新形成的醛基被直接进一步氧化为羧基，浓度过低则无法使糖基氧化。针对不同批次的酶之间存在糖基化程度有差别的特点，使用过碘酸钠法时需对不同批次的方法有所调整。另一方面，由于重组抗体和许多单克隆抗体不含糖基，若准备用该法连接这类抗体时，需事先确定抗体上是否有合适的修饰位点。戊二醛法和过碘酸钠法各有优点，也成为了商业法酶标抗体（如Sigma公司）的主流制备方法，但这两种方法都涉及使用高浓度的酶和抗体，也需要较为繁琐的分离与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析或亲和层析柱纯化等。

近年来，纳米技术发展迅速，新兴的纳米材料也层出不穷，这为新一代的酶标抗体的发展提供了可能。西班牙Merkoci课题组分别于2007年和2010年报道将HRP二抗和胶体金结合形成胶体金HRP二抗复合标记抗体用于酶联免疫检测，结果表明新的酶标抗体能使检测的灵敏度提高10倍左右。该复合抗体是将传统方法制备的酶标记抗体以胶体金表面能承受的饱和吸附量吸附到胶体金表面，形成包被有酶标二抗的纳米胶体金。当胶体金上的任一抗体参与抗原捕捉后，与该抗体连接着的胶体金上的其他酶标记抗体都可以参与信号示踪（如加底物后显色），从而使灵敏度提升。另一方面，胶体金的相对大的表面积足以同时容纳更多的酶标记抗体（如1个18nm胶体金离子可容纳约13个HRP），Merkoci课题组使用的这种高灵敏度的胶体金复合酶标特点在于使参与信号示踪的酶标量增多，突破传统酶标抗体在参与捕捉抗原后，只有酶标抗体其自身所带1～2倍数量酶标分子能参与信号示踪这一局限。该胶体金复合酶标记抗体虽有更高的灵敏性，但是仍以制备好的传统酶标抗体为基础，并没变传统意义上抗体与酶的偶联过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备酶标记抗体的方法，能以未经偶联的抗体和酶为基础，结合纳米材料（胶体金）制备高灵敏度的新一代酶标记胶体金复合抗体。为此，本发明采用以下技术方案：它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的pH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混匀，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶复合抗体。