[发明专利]一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法。

背景技术

干细胞向成体细胞的发育与分化在基因水平受精密调控，而逆转成体细胞的分化状态至多潜能的干细胞状态即为重编程。2007年日本、美国的科学家 (Takahashi et al. 2007；Yu et al. 2007；Park et al. 2008) 相继报道，在人类体细胞中通过逆转录病毒（或慢病毒）过表达四个转录因子基因（Oct4, Sox2, Klf4与c-Myc，或者Oct4, Sox2, Nanog与Lin28），逆转人类成体细胞的分化状态，获得多能潜能干细胞（iPSC，induced pluripotent stem cell）。有报道证实，通过病毒载体导入Oct3/4和Sox2两种转录因子基因，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞（Danwei Huangfu,2008）。2009年3月5日，Cell报道Rudolf Jaenisch研究组利用Cre-重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPSC无外源因子，使iPSC临床应用又推进了一步。2009年3月26日，Science报道俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPSC（俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞，科学，2009.324:7797-801）。人类体细胞重编程为多潜能干细胞（iPSC）是近两年来干细胞研究领域的重要里程碑事件。在2007-2008年连续两年被science杂志评为十大科学进展(Kennedy 2007；Vogel 2008)。

通过调控体细胞重编程，使成体细胞获得与胚胎干细胞（ESC）相似的多潜能性，具有非常重要的研究和潜在的细胞替代治疗价值。人类iPSC和胚胎干细胞能够特异性的表达SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81等表面抗原，以及Nanog、Oct4等核转录因子基因。通过悬浮培养，iPSC和胚胎干细胞能形成胚状体（EB）后，能够分化形成人类胚胎的三个胚层的细胞，表达三个胚层所特有的基因。这些特性是判断iPSC具有类似未分化的人类胚胎干细胞的标准。由于多潜能干细胞（iPSC）具有多向分化潜能，越来越多的研究者正在探索体外诱导iPSC分化，用于不可再生细胞的替代治疗。此外，由于患者来源的iPSC携带相应的致病基因和特异的细胞病理过程，研究人员已经从I型糖尿病、帕金森病和另外至少十几种疾病的患者身上诱导获得iPSC，这些疾病特异的iPSC可作为疾病的细胞模型，对于研究人类疾病具有重要意义。

尽管iPSC吸引各国研究者开展大量研究，然而目前现有的诱导人类或灵长类体细胞为iPSC的技术体系面临如下问题：①其效率极低，约1/10000左右，②诱导时间漫长，约24天左右。③各个研究小组所获得的iPSC其细胞表型，基因表达及其功能均有差异。上述技术问题在很大程度上限制了iPSC的研究应用。

因此，要使人类iPSC在再生医学和疾病发生研究中得到广泛应用，必须探索一种高效诱导策略，缩短重编程所需时间，简化诱导过程。

发明内容

本发明的目的是提供能够高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞，同时缩短重编程时间的手段，本发明的另一个目的是提供使用该手段的方法。

本发明人以实现上述目的为目标进行了广泛的研究，并且发现在将核重编程因子与体细胞接触之前，用含甲状腺激素T3或T4培养基培养体细胞，可以显著的增加iPSC形成效率。

一种诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法：包括以下步骤：

A.用含甲状腺激素T3或T4的培养基培养体细胞2-4天；

B.将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触，继续培养，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到多潜能干细胞。

所述甲状腺激素T3或T4浓度优选10^-10-10^-7mol/L。加入的甲状腺激素T3或T4能够促进细胞增殖和细胞能量代谢，提高重编程效率和缩短诱导周期。

所述核重编程因子为能够诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的因子，该核重编程因子以DNA、mRNA或蛋白质形式与体细胞接触。

所述核重编程因子可来源于不同的物种，优选与所使用体细胞相同来源的生物，如体细胞为人成纤维细胞时，所述核重编程因子优选为人的核重编程因子及其变体。

优选的，所述核重编程因子以DNA形式与体细胞接触，所述DNA为分别带有相应核重编程因子编码序列的载体。