[发明专利]一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法：包括以下步骤：

A.用含甲状腺激素T3或T4的培养基培养体细胞2-4天；

B.将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触，继续培养，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到多潜能干细胞；所述核重编程因子以DNA、mRNA或蛋白质形式与体细胞接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A所述甲状腺激素T3或T4浓度为10^-10-10^-7mol/L；步骤A所述体细胞为灵长类动物的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、毛囊细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤B所述将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触后，需继续用终浓度为10^-10-10^-7mol/L的甲状腺激素T3或T4的培养基培养5-8天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B所述核重编程因子包含Oct3/4和Sox2、Sox1中的一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述核重编程因子还包含Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤B所述核重编程因子以DNA形式与体细胞接触；所述DNA为带有相应核重编程因子编码序列的载体；所述载体为病毒载体或质粒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。

8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：步骤B具体为将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触后，继续培养18-30小时，然后换20%FBS-DMEM培养，3-5天后传代至饲养层细胞继续培养3-5天，最后换ESC培养基培养3-5天即可得到多潜能干细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触的同时补充加入新鲜培养液；所述饲养层细胞为用丝裂霉素处理使其失去增殖能力的胚胎期13.5天的小鼠成纤维细胞。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述ESC培养基是由knockout DMEM或DMEM/F12、5-100ng/L碱性成纤维细胞生长因子、2mmol/L L-glutamine、0.1mmol/L b-巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5-25ug/mL抗支原体药物plasmocin以及抗生素组成的培养基。