[发明专利]表达禽流感病毒血凝素（HA）基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株（rDEVus78Ha）及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。本发明提供一种表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201025，命名为rDEVus78Ha，及其构建方法和应用。 

背景技术

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒^[1]，而未能进一步将其进行分类。直到最近，其全序列才被全部测通^[2]。自2007年，本研究室开始了DEV疫苗株基因组的测序工作，通过构建DEV疫苗株全基因组粘粒文库，分段对其进行测序和分析，至2009年中期，已将DEV疫苗株全基因组测序工作完成。几乎同时，Li等也报道了DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近^[2]。而同为禽类疱疹病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HTV)属于马立克病毒属，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹦鹉疱疹病毒(PsHV)为传染性喉气管炎病毒属。 

自上世纪80年代成功利用痘苗病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前，已有大量的 相关研究报道。在常见畜禽疱疹病毒疾病中，如以伪狂犬病毒(PRV)为载体，分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果^[4-11]。用在鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的UL0和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好^[11-13]。同样，Sakaguchi M(1993；1994)和Sonoda K(1996)等分别在MDV1的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫1日龄无特定病原鸡(SPF鸡)，1周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80～100％^[14-16]；在MDV1的US10中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDV1相当^[17，18]；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击^[19]。现在，我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。作为α疱疹病亚科一员，DEV也应该是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。但DEV的基因组成及结构与MDV等有着较大的差异，如MDV的基因组结构为TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，而DEV基因组的结构是UL-IRS-US-TRS。且DEV与同亚科的另外几种畜禽疱疹病毒在动物体内生长复制的生物学特点也不尽相同。因此，在PRV、MDV、ILTV中可稳定插入外源基因的位点不一定适用于DEV。 

由于对DEV的研究相对滞后，至今为止，国内外关于DEV基因中复制非必需区的研究报道仍是空白。常用于构建疱疹病毒重组病毒的方法有三种。一种是同源重组；第二种是将病毒基因组插入BAC中，然后在BAC上构建突变，用其转染相应细胞拯救出重组病毒；第三种是将含有相互重叠区的疱疹病毒基因片段分别插入粘粒中，并在其相应区段上构建突变，再用其共转染相应细胞拯救出重组病毒。然而对于DEV这种基础研究缺乏、分类不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二种方法构建重组病毒工作量大，且效率低。而第三种方法的难点在于多粘粒感染性克隆的建立，如果这个平台构建成功，将能快速有效的构建重组病毒。至今，疱疹病毒的这种感染性克隆构建技术已比较成熟，且已见诸报道^[20-27]。