[发明专利]一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法，用作超声造影剂与整合素αvβ3受体结合超声显像来评估早期肝纤维化。

背景技术

迄今，肝活检仍是评估肝纤维化的唯一“金标准”。然而，肝活检是有创的，可引起致命的并发症，因此不能被患者普遍接受，这造成了很大一部分慢性肝病患者在诊断和治疗上的延误；同时，在无明显症状的患者中，很难重复进行肝活检，这就无法准确地随访慢性肝病患者病情的变化；此外，样本取样误差和病理观察的不一致性都影响了肝活检的准确性。因此，需要一种精确的无创伤性的方法来诊断和评估肝纤维化。目前，肝纤维化无创伤性的评估方法有：1纤维化血清标记物。器官特异性差，易受炎症和机体代谢的干扰，标准化困难，组合指标更多反映炎症，对纤维化分期较困难；2生化指标。需多项组合（如Fibrotest）。由于肝脏极强的储备功能，只在严重肝纤维化时改变明显，并且生化指标影响因素多，解释困难，不同病因、不同时期的肝纤维化评估的准确性不同；3常规影像。目前常规B超、CT、MRI难于反映肝纤维化早期改变，评估多限于肝硬化及并发症；4发展中的影像技术。近年推出超声检测低频弹性波的瞬时弹性记录仪（Fibroscan）和运用MRI弥散加权成像(DWI)、³¹磷波谱成像(³¹MRS)及弹性成像变化等新技术，通过测量肝组织硬度和弹性来评估肝脏纤维化程度，优于其他的无创的方法，具有一定的应用前景。然而，近来的研究发现也存在一定的局限性，如腹壁脂肪的含量在很大程度上影响Fibroscan等对肝纤维化的检测准确性，并且这些方法在对早期肝纤维化的诊断上也存在困难。

综上所述，目前诊断和评估肝纤维化的方法都未能较好反映慢性肝损伤修复过程中活化细胞表型和数量变化等分子病理改变，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面存在不一致性，尚难达到临床对肝纤维化早期诊断和治疗效果实时动态评估的要求。不能对肝纤维化做出正确评估一直以来是制约基础研究走向临床的“瓶颈”，也是不能开发抗纤维化药物与临床试验的关键环节。

发明内容

本发明的目的是提供一种能提高超声显影的灵敏度的脂质体微泡及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。脂质体微泡中包裹氮气和全氟碳的混合物，起到超声显影作用。

所述的肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体为至少一种在病理状态下上调的受体，如整合素αvβ3受体。

所述的靶向环肽为环（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸），即c(RGDyK)，其可以特异性结合肝星状细胞，从而达到特异性肝纤维化诊断并提高诊断灵敏度的目的。环肽中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列是新生血管内皮细胞多种整合素受体结合位点。其中，y代表右旋酪氨酸残基，K代表赖氨酸残基且不影响与靶向受体结合。

本发明还提供了上述靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将摩尔比为1.1~1.3：1的靶向环肽与生物素-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯共同溶解于pH=8的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-5小时，过滤，得到靶向环肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制备型HPLC纯化，冷冻干燥得纯品；

第二步：在冰上将第一步得到的靶向环肽-聚乙二醇-生物素纯品和带有链酶亲和素的脂质体微泡分别溶解于生理盐水中，将上述两种生理盐水溶液混合，得到靶向环肽修饰的脂质体微泡。

所述的c(RGDyK)的制备方法如下：利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以O-(IH-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基异脲六氟化磷和二异丙基乙胺为缩合剂，依次在芴甲氧羰基-甘氨酸-二氯三苯甲基树脂上（Fmoc-Gly-2-Cl-Trt  resin）接入侧链保护的精氨酸（R）、赖氨酸（K）、d-酪氨酸（y）和天冬氨酸（D），经1%三氟乙酸（TFA）切割后得到侧链保护的线状肽链D(otBu)-Y (tBu)-K(Boc)-R(Pbf)-G。再在DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）进行环化而得。

本发明的原理如下：