[发明专利]一种高效发酵生产脂肪酶的方法

说明书

技术领域

一种高效发酵生产脂肪酶的方法，尤其是一种控制诱导工艺高效发酵生产脂肪酶的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)全称Triacylglycerol acylhydrolase，能够水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用。因此，脂肪酶可以说是专门在异相系统或者非水介质中油(或酯)与水的界面上催化的酶。通过控制反应体系中水的含量，改变反应条件可以使水解反应向合成方向进行，这些反应通常具有高度的区域或立体选择性。自然界中的脂肪酶广泛地存在于各种生物体中，包括人类和植物。人体和其它动物体中，脂肪酶主要功能是对油脂进行消化、吸收和修饰。在植物中，脂肪酶在茉莉酸防疫体系和病原体诱导的水杨酸生成过程中起重要作用。在微生物中，脂肪酶则是用于对油脂的水解而生成脂肪酸，脂肪酸再进入β-氧化途径提供能量，并且在微生物油脂的储存中也起到一定的作用。

微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度，并适合于工业化大生产，所以微生物是脂肪酶的一个重要来源，其中根霉属(Rhizopussp.)微生物是脂肪酶的重要生产菌（Jaeger K E and Eggert T. Curr Opin Biotech, 2002, 13: 390-397）。在过去的十多年里，从根霉菌中分离到超过30种脂肪酶，多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂。各种各样的微生物，包括细菌、酵母和霉菌都能用于脂肪酶的生产，并且这些脂肪酶都广泛用于清洁剂、食品、香料、手性医药中间体、生物材料和一些化学品的生产中（Hasan F, et al. Enzyme and Microbial Technol, 2006, 39:235-251）。

然而在脂肪酶生物催化的工业生产过程中，催化剂脂肪酶是一个很大的限制因素，自然条件下，菌株产脂肪酶量较低，利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要。因此研究人员把注意力集中到克隆和表达脂肪酶基因上，通过基因表达调控来提高脂肪酶的活力。

甲醇营养型毕赤酵母（Pichia pastoris）作为能够实现外源蛋白高效表达的优秀宿主菌，在学术和工业技术上的应用越来越广泛。它具有许多真核表达系统所特有的特点，如蛋白酶加工，折叠，二硫键形成和糖基化作用等（Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24:45–66.）。在以AOX酶启动子控制的基因工程菌表达外源蛋白培养过程中，甲醇补料策略是一个非常重要的影响因素。为了避免甲醇积累对细胞的毒害作用和对细胞生长的不利影响获得目蛋白的高效表达，不同甲醇补料策略得到应用。Stephan（Stephan Hellwig，Frank Emde，Nicole P G.Analysis of Single-Chain Antibody Production in Pichia pastoris Using On-Line Methanol Control in Fed-Batch and Mixed-Feed Fermentations[J].Biotechnology and Bioengineering.2001，74:344-352.）等在已建立的毕氏酵母发酵过程结构模型基础上，进行了甲醇流加阶段恒定比生长速率。研究发现在比生长速率均值相等的情况下，恒定比生长速率进料策略较之恒速进料策略蛋白产量高25%。Cunha（Cunha A E，Clemente J J，Gomes R，et al. Methanol Induction Optimization for scFv Antibody Fragment Production inPichia pastoris[J]. J Ferm Bioeng.2003，82: 82-87.）等通过对恒定补料速率和变速补料比较发现恒速补料策略（1.0）更适合外源蛋白表达。Yu（Xiao-Wei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu.Rhizopus chinensis lipase: gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57:304-311）等通过甲醇电极恒定控制甲醇浓度来表达华根霉脂肪酶，但未能采取其他甲醇流加策略进行研究比较。