[发明专利]壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术免疫制剂领域，涉及疫苗的载体系统及制备方法和应用，特别涉及利用壳聚糖微球作为基因疫苗载体，诱导快速并且强烈的体液和细胞免疫应答，用于传染性疾病的预防和治疗。

背景技术

基因疫苗既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫，被称为疫苗的第三次革命。基因疫苗目前已被用来在临床前使用的多种病毒、细菌和寄生虫动物模型中激发保护性抗体和细胞介导的免疫应答，并且在防治癌症、变态反应和自身免疫性疾病方面进行了研究。然而，裸DNA在细胞内外及体内外不稳定，容易被核酸酶降解；其天生的负电荷限制了与负电荷的细胞膜接触而内在化。从而使得基因疫苗的免疫原性低下，需要高剂量的基因疫苗才能诱导足够的免疫应答。因此现在基因疫苗的瓶颈，就是载体问题。如何能够有效的将抗原基因基因释放到靶细胞内而又较少的产生副作用，即是要解决载体的效率、靶向性和安全性的问题。

目前应用的基因疫苗载体主要为病毒载体和非病毒载体，在临床试验研究中，有三分之二采用病毒载体。病毒载体存在诸多缺陷，如具有免疫原性及细胞毒性、缺少组织特异性、对装载外源基因大小有限制、有潜在的致瘤性，以及在重组过程中可产生活性的病毒颗粒等。非病毒载体大部分为多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物，具有低毒、低免疫原性、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制、使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。在许多不同的实验与治疗方面，表现出了多种潜在的优越性。

在这些非病毒载体中，壳聚糖由于其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性和免疫原性，成为近年来研究的热点。而且壳聚糖的结构单元葡萄糖胺能够识别抗原提呈细胞表面的甘露糖受体，使之成为基因疫苗的良好载体。而金纳米颗粒，由于其制备简单，生物惰性，并且很容易修饰偶联功能分子，作为非病毒基因载体，展示了一个独特的技术平台。更重要的是，现在已有实验表明，金颗粒可以作为抗原提呈细胞的引诱剂，较少免疫反应的时间，提高免疫反应的效率。结合壳聚糖和金纳米颗粒的优势，壳聚糖微球极有可能成为一个迷人的基因疫苗非病毒载体。

而且，这种壳聚糖微球由于其良好的粘膜黏附性能，还能通过粘膜和口服给药。除了避开对痛苦的注射需要和相关的因“针头恐惧”所致的对患者顺从的不利影响外，已有动物实验表明经粘膜给予抗原诱发保护性应答的效率更大。而且，粘膜是许多病原体进入的途径，因此粘膜接种是吸引人的。例如：鼻内接种，不仅可以在鼻粘膜中诱导粘膜免疫，而且在远端粘膜部位如生殖器粘膜中也诱导粘膜免疫(Mestecky，1987，Journal of clinical Immunology，7，265-276；McGhee，Infectious Agents and Disease，1993，2，55-73)。

因此，本发明利用壳聚糖微球作为基因疫苗的载体，增强了基因疫苗的免疫原性。其原理在于：

1.壳聚糖(chitosan)可以通过静电、疏水相互作用、氢键与核酸疫苗作用，浓缩核酸疫苗成为致密状态，减少其体内降解。

2.免疫注射后，金颗粒可以作为免疫细胞，特别是抗原提呈细胞(APCs)的粒子引诱剂；壳聚糖本身也有免疫加强的作用。

这种研究基因疫苗载体的新思路，到目前为止，在国际上仍旧是独一无二的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于预防性和治疗性基因疫苗的载体系统及其制备方法。

本发明将基因疫苗和壳聚糖复合物免疫动物后，能够诱导强的体液和细胞免疫应答，并且缩短免疫应答的时间，能用于传染性疾病的预防和治疗。

本发明的目的是提供了一种用于预防性和治疗性基因疫苗的载体系统及其制备方法及其应用：

50mL 1.0×10^-4g/ml氯金酸(HAuCl₄)水溶液剧烈搅拌下加入不同浓度(0.01％-0.5％w/v)的壳聚糖乙酸溶液，冰浴条件下快速加入适量的硼氰化钠，继续搅拌30分钟。

壳聚糖/疫苗微球的制备是壳聚糖和DNA共凝聚的过程。壳聚糖的阳离子特性是其必要条件。具体操作是在固定的体系里(1×TAE)，固定DNA疫苗的质量，改变壳聚糖的质量，分析不同N/P(0.1～1.0～10.0)下凝胶电泳的结果来筛选最好的(壳聚糖/DNA)比例。硫酸钠作为去溶剂化试剂(5mM-50mM)进入这个体系，稳定形成的壳聚糖/疫苗微球。

经过BALB/c动物实验表明，该载体系统能够提高特异性抗体水平，更主要的是Th1型细胞因子的水平得到显著提高，并且在低抗原剂量的条件下显著增强细胞免疫应答(CTL)。