[发明专利]一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及菌剂制备方法，尤其是涉及一种含有分泌表达抗肿瘤AZURIN蛋白的大肠杆菌 Nissle 1917和菌剂及菌剂制备方法。

背景技术

随着世界人口和寿命的增长，癌症发病率和死亡率持续上升。世界卫生组织(WHO)提供的《世界癌症报告》表明，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。目前全世界发病率最高的癌症是肺癌，每年新增患者为120万人；其次是乳腺癌，每年新增大约100万名患者； 随后依次是肠癌(94万人)、胃癌(87万人)、肝癌(56万人)、宫颈癌(47万人)、食道癌(41万人)等。其中杀伤力最强的是肺癌、胃癌和肝癌，分别占癌症死亡人数的17.8%、10.4%和8.8%。有关癌症的防治及治疗的研究已成为生物医学领域十分引人注目的课题之一。传统的化疗、放射疗法副作用大，肿瘤易复发和转移；手术治疗只对早期发现的肿瘤有效果，而一般肿瘤很难在早期被发现；脂质体包埋和靶向抗体治疗肿瘤等新方法，虽然在肿瘤靶向性上有了很大提高，但脂质体包埋的安全性还有待进一步验证，抗体靶向治疗的残留毒性也有待解决，现在还无法大规模推广应用。

细菌靶向治疗肿瘤是利用细菌对肿瘤的高靶向性，通过细菌自身的抗肿瘤效应，或与传统的化疗、放疗、脂质体包埋、RNA干扰、基因修饰等相接合而达到诊断和治疗肿瘤的目的。研究最广泛和最深入的两种肿瘤靶向性细菌—减毒诺维氏菌（Clostridium novyi-NT）和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009（Salmonella typhimurium  VNP20009）已在美国进入临床试验阶段。

肿瘤靶向性细菌之所以被人们广泛关注，一方面是由于它们自身的抗肿瘤作用，另一方面是它们的靶向性。肿瘤靶向性细菌能够在肿瘤低氧坏死区生长繁殖，这正是化疗、放疗的盲区，因此肿瘤靶向性细菌被用于辅助化疗、放疗并取得了良好的效果。市场上的抗癌药物除了可以抑制杀死肿瘤细胞外，对人体的正常组织也有很大的毒害作用。因此肿瘤靶向性细菌被作为载体表达前体药物转换酶、血管形成抑制物、RNAi干扰因子或与脂质体结合来治疗肿瘤，并取得了明显的效果，最大限度减少了药物对正常组织的损害。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对肿瘤具有靶向性，抗肿瘤效率高，抗癌谱广，经济、安全的治疗肿瘤的抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及菌剂制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

研究表明，大肠杆菌 Nissle 1917是非致病性益生菌，已被临床上用于治疗新生儿痢疾，亦被用作日常生活的肠道保健菌。更重要的是，大肠杆菌 Nissle 1917对肿瘤具有高效靶向性。在对免疫耐受和免疫弱化小鼠的实验中，大肠杆菌 Nissle 1917在经小鼠静脉注射25天后在肿瘤中的量达到了10⁶CFU/g，而在其它正常组织完全消失。

另外，从绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中提取到的AZURIN蛋白是一种高效的抗肿瘤蛋白。它对正常组织细胞没有任何毒副作用，却有高效的抗肿瘤作用。其一旦进入肿瘤细胞，就可通过复杂的机制引起细胞凋亡，干扰肿瘤信号的传导及抑制血管生成；它还可分泌15kb DNA到细胞外，通过TLR9介导的NF-KB发挥抗肿瘤作用。

本发明之抗肿瘤靶向工程菌，含有抗肿瘤分泌表达载体pLAC-HA（此载体在pSUMO载体上通过同源重组构建），其分类命名为大肠杆菌LMA1（Escherichia coli LMA1）；保藏日期：2010年11月24日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）；保藏单位地址：武汉，珞珈山，武汉大学内；保藏编号：CCTCC NO：M 2010313。

本发明之抗肿瘤靶向工程菌，构建所用的整合表达载体为pLAC（此载体在pSUMO载体上通过同源重组构建），采用截断后的P_lac组成性表达启动子，增强表达小肽Ehp（此增强表达小肽的序列为ATGACCATGATTTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAA）。

本发明之抗肿瘤靶向工程菌的构建方法：将截断的P_lac启动子、增强表达小肽Ehp与pEHA，通过重叠PCR技术获得包含三段基因序列的PCR产物，再通过RED/ET重组技术将PCR产物重组整合到表达载体pLAC，电击转化大肠杆菌 Nissle 1917，即得到大肠杆菌LMA1。