[发明专利]一种通过组织工程构建的食道组织

说明书

技术领域

 本发明属生物医学工程领域，具体涉及一种通过组织工程构建的食道组织。

背景技术

我国是食道癌的高发国家，又是食道癌死亡率最高的国家，目前临床的治疗原则一般为经胸食道癌切除和一期重建消化道。最常见的食道替代品为胃，结肠和小肠。所行手术创伤大，涉及范围广，并发症多，其中吻合口痰的发生率在 3 ％- 5 ％左右，是一种典型的以创伤修复创伤的治疗模式。人工食道的研制由于尚无组织相容性良好的合成材料，进展缓慢。

组织工程是二十一世纪生命科学一大热点。其核心内容是体外细胞三维培养，其基本方法是将种子细胞与可降解生物材料组成复合体，替代受损组织器官。其科学意义不仅在于为解除病人痛苦提供了一种新的治疗方法，更主要的是提出了复制”组织”、”器官”的新思想，改变了既往以损伤修复损伤的医疗模式。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种通过组织工程构建的食道组织，改变既往以损伤修复损伤的治疗模式。本发明根据组织工程学基本原理方法，利用组织工程化皮肤支架材料作为可降解支架材料，在体外构建有上皮层和真皮层的食道组织。所述的真皮层包含由血管内皮细胞及成纤维细胞。

本发明所采用的组织工程化皮肤支架材料可以是聚聚羟基乙酸 ( PGA ) ，皮肤脱细胞基质。其中皮肤脱细胞基质包括同种异体真皮脱细胞基质和异种真皮脱细胞基质。

本发明采用的可降解支架材料猪真皮脱细胞基质，购自上海东润生物制品公司。经临床试用一千余例烧伤病例，证实其组织相容性、细胞相容性良好。

本发明具有下述优点 

1 ．本组织工程化食道组织是可自我更新，自我修复的活组织，无抗原性，不会引起免疫排斥反应。 

2 、本发明利用血管内皮细胞加速了重建组织工程化食道血液供应。

完整的上皮组织可防止肉芽组织增生堵塞管腔，是组织工程化食道成功的关键。正常组织再血管化主要有血管生成、血管发生两种形式。血管生成即局部血管再生是指正常组胞因子刺激下游离至再生组织生成毛细血管。血管发生则由骨髓中血管内皮细胞在某些细胞因子刺激下游离至再生组织生成毛细血管。本发明同时利用上述两种再血管化方法，短时间内与受体血供再通，从而为组织工程化食道上皮提供血供。

具体实施方式

实施例 1 

1 ）分离与培养表皮角肮细胞

取患者表皮修剪成宽 1-2mm的条状，无钙镁 PBS 漂洗两次，表皮面朝上浸于 0.5 ％中性蛋白酶中 4 ℃ 过夜。将表皮从真皮上撕下后，剪碎，用 0.05 ％胰酶-0.53mM EDTA 在 37 ℃ 消化 20 分钟， 10ml 胰酶抑制剂终止消化。经 150 目不锈钢滤网过滤、离心（ 1200 转， 10 分钟）、计数后制成单细胞悬液，按 3×10⁶/75cm²密度接种培养，无血清表皮细胞培养基（ GIBRO , USA ) ，另加牛垂体提取物和重组表皮细胞生长因子，在 37 ℃ ， 5 % CO₂，饱和湿度的培养箱中培养，培养液 3 天换一次。当细胞达到 60 - 75 ％密度融合时，经 0.05 ％胰酶 37 ℃ 消化 10 分钟，按 1 : 3 的比例传代培养。 

2 ）真皮成纤维细胞分离与培养

分离消化

将上述真皮碎块，在 0.2 ％的胶原酶 37 ℃ 消化 2 小时，经15O 目不锈钢滤网过滤，以 1200r / min 离心 5 分钟，弃去上清，加入无钙镁 PBS 清洗 3 次。加入含 10 ％胎牛血清的 DMEM 培养液 1Oml ，混匀，台盼蓝染色计数。

原代培养