[发明专利]扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及用于扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法。

背景技术

红球菌属细菌属于放线菌目棒杆菌亚目诺卡氏菌科，是一类好氧，不产生孢子的革兰氏阳性菌，少数可能致病。红球菌属中的主要成员包括：嗜粪红球菌、马红球菌、滕黄红球菌、红平红球菌等。红球菌具有一个相对快速和简单的生长周期，可作为实验系统进行科学研究。大多数红球菌能在广泛的环境中生长，比如沙漠，水体等。

红球菌具有重要的应用价值，红球菌的一个重要作用是生物转化。红球菌能利用自身的生物系统将原料进行生物转化，如能利用很多有机物生成类固醇、丙烯酰胺和丙烯酸等。另外红球菌能降解及利用一些环境污染物及有机物如烷烃，红球菌能够代谢有害的环境污染物，例如甲苯、萘等，并且与化石燃料的生物脱硫作用有关。同时它的一些种对人、动物或植物都有影响。因此，红球菌越来越为人们所关注。

现有技术中，有如下两种常用的对红球菌进行鉴定的方法：

1、生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法，此方法需要得到菌株的纯培养物，且实验周期长，实验结果受人为观察影响因素较大，准确性不高。

2、提取菌株DNA进行测序。目前是用16SrRNA基因引物进行PCR扩增，将扩增出的DNA片段进行测序。此方法结果比较准确。但仍需要得到菌株的纯培养物，无法从混合样品中快速鉴定是否含有红球菌。

因此本领域迫切需要开发出一种能够快速、准确判定红球菌的方法。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是针对现有技术鉴定红球菌试验周期长、适用范围窄的不足，提供一种能够快速、准确、方便，可对混合样品中是否含有红球菌进行快速判定的方法。

为实现上述目的，本申请的发明人设计了一对针对红球菌假想保守膜蛋白(conserved hypothetical membrane protein)基因片段的PCR引物，其上游引物：AATCCTCCTGAACGTGATCTG，其序列如SEQID No.1所示；

下游引物：CTATGCATAATTGACGCGGT，其序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

假想保守膜蛋白conserved hypothetical membrane protein基因是对红球菌基因组序列进行序列分析后根据生物信息学推断出的一个″假想″保守膜蛋白基因序列，该片段序列保守，在红球菌基因组中的位置为5076659-5077076，其序列为aa tcctcctgaa cgtgatctgg ctggtgttcggcggcttctg gctggcgttg ggttacttcg ccgcaggcat catctgctgc atcctcatca tcacgattcccttcggaatc gcggcattcc gcatcggcat ctacgcactg tggccgttcg gtaagaccgtcgtcgacaag ccgaccgctg gtgtcggttc gatgatcggc aatgtcatct gggtgatcatcgccggtatc tggttggcga tcggacacat cgtcaccgcc gtcgcgatgg cgatcacgatcatcggaatt ccgctcgcgg tcgcgaacct gaagatgatt ccgatctcgc tgatgccactcggcaaggag atcgtcgacg tggaccgcgt caattatgca tagccgtgga ccgcgtcaattacgcatagc cgtggaccgc gtcaattacg cgtaa(如SEQ ID No.3所示)

经过生物信息学研究发现，选择其它红球菌属的几乎所有小片段的模板设计出的引物都不具备特异性，比如推论的水解酶(putativehydrolase)，氧化还原酶(oxygenase reductase)等，而只有选择这段模板设计出的引物，具有较好的特异性。

本发明还提供一种检测红球菌的方法，包含以下步骤：

步骤1：按如下比例配制反应体系：

PCR buffer：10μL

dNTP：4μL