[发明专利]动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物血液复杂基质中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法。该方法利用同位素标记物作为内标物，采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。

背景技术

吸烟与健康问题日益引起人们极大关注，烟叶和卷烟烟气中的一些有害成分，特别是具有强致癌性的烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）,更加引起各国科学家们的极大关注[刘万峰，王应元．烟草中烟草特有亚硝胺的研究进展. 中国烟草科学, 2002，（2）:11-15]。研究TSNAs在动物体内的代谢产物和代谢过程，开展TSNAs的代谢历程研究，可为TSNAs的毒性抑制研究提供依据，为缓解吸烟与健康矛盾提供技术支持。

烟草中主要存在四种形式的N-亚硝胺：挥发性N-亚硝胺、非挥发性N-亚硝胺、烟草特有N-亚硝胺和亚硝化的氨基酸。卷烟烟气中已发现的亚硝胺达35种，而烟草特有N-亚硝胺的研究最早开始于20世纪60年代初期且最受关注，这是因为部分TSNAs具有致癌活性，它们对吸烟者和被动吸烟者的健康可能有不利影响。目前已经鉴定出8种TSNAs，其中N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱（NAB）和4-(N-甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)在烟草中的含量比其它几种TSNAs要高；现已证明NNN和NNK是TSNAs 中致癌性最强者，NNK及其主要代谢物4- (N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-丁醇（NNAL）是目前为止烟气中发现的唯一胰腺癌致癌物。

对TSNAs的检测通常使用薄层色谱法、极谱法、紫外-可见分光光度法、液相色谱法和气相－热能分析检测法等[J.D. Adams, K.D. Brunnemann, D. Hoffmann. Chemical studies on tobacco smoke. LXXV. Rapid method for the analysis of tobacco-specific N-nitrosamines by gas-liquid chromatography with a thermal energy analyzer. J. Chromatogr.1983, 256:347.]。近年来液相色谱－质谱联用（HPLC-MSⁿ）方法[D. Kavvdias, G. Scherer, J. Shepperd, F. Cheung, G. Errington, M. McEwan. Dermination of tobacco-specific N-nitrosamines in urine of smokers and nonsmokers. The CORESTA Congress, Shanghai, China, 2008]开始应用于烟草和烟气中TSNAs及其代谢物的分离分析。由于复杂生物基质样品中TSNAs及其代谢物含量水平仅为ng级、甚至更低，因此应用液相色谱串联质谱法（HPLC-MSⁿ）进行测定具有很大的优势。但是HPLC-MS方法也存在一定缺陷，如在定量分析过程中由于内标物与待测物不一致，导致在样品前处理时待测物与内标物存在歧视现象，使得测定结果存在偏差，而选用同位素标记物作为内标物可以有效消除这种歧视现象，提高定量分析的准确度。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题，而专门开发的一种动物血液复杂基质中烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法，本方法针对上述不足之处，同时还可以大幅度减少样品收集后进行繁琐地固相萃取纯化、溶剂浓缩等过程，可以直接并准确的测定动物血液复杂基质中TSNAs的含量，该方法操作简单，灵敏度高，结果可靠。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法,将动物血液样品放入加有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆加入NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3混合内标溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。

该方法具体包括以下步骤：

a、动物血液样品收集；