[发明专利]动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法

权利要求书

1.一种动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于：将动物血液样品放入加有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆加入NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3混合内标溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，采用LC-MS/MS分析检测样品中烟草特有N-亚硝胺的含量。

2.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：

动物血液样品收集；

混合内标溶液配制：以同位素标记物NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3作为内标物，配制浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液；

混合标准溶液配制：分别称取NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL，配制具有浓度梯度的NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液，并各加入1ml浓度为50ng/ml的混合内标溶液；

标准曲线绘制：将TSNAs系列（NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL）标准溶液按由低到高浓度顺序进行HPLC-MS/MS分析，并以各TSNAs与其内标的峰面积比（Y）对其相应的浓度（X，ng/mL）进行线性回归分析，得到各TSNAs的工作曲线回归方程和相关系数；

样品前处理：将动物血液样品放入加有0.1 mL乙二胺四乙酸二钾（EDTA-k2）饱和水溶液的1.5 mL离心管内，10000 rpm离心，取上层血浆0.5 mL加入0.5 mL 浓度为50ng/ml的混合内标（NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3）溶液，静置30 min沉淀蛋白后，取上层液过滤，进行HPLC-MS/MS分析； 

数据处理和分析，对动物血液中痕量TSNAs及其代谢产物进行检测，揭示TSNAs在动物体内的代谢规律。

3.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于：混合内标溶液配制方式如下：准确称取NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3各10 mg, 分别置于5个1000 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为10 μg/mL的 NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNAL-d3的内标储备溶液，各移取5 mL内标储备溶液置于一支1000mL容量瓶中，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，配制得浓度均为50 ng/mL的混合内标溶液。

4.根据权利要求1所述的动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺的分析方法，其特征在于：具有浓度梯度的NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液配制方式如下：准确称取NNN，NNK，NAT、NAB、NNAL 各10 mg，分别置于5个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg/mL的 NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL的标准储备溶液；移取10 mL的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL标准储备溶液，均置于同一支100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得一级混合标准溶液；移取1 mL一级混合标准溶液，置于另一100 mL容量瓶中，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得二级混合标准溶液；取0.01、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和25.0 mL二级混合标准溶液，分别置于100 mL容量瓶中，各加入1 mL二级混合内标溶液，用50/50（体积比） 乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度均为0.125、0.250、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和25.0 ng/mL 的NNN、NNK、NAT、NAB、NNAL系列混合标准溶液。