[发明专利]壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料用于标记生物及生物体系的分析检测技术领域，更具体涉及一种壳聚糖-量子点荧光探针用于狗肾细胞标记的方法，通过对细胞组分以及亚细胞结构的标记，可以用于的细胞的生理活动研究，也可用于细胞内外各类受体的运输途径研究及外源性污染物与细胞相互作用的研究。

背景技术

壳聚糖是由甲壳素脱去乙酰基的产物，其大分子链上分布着许多羟基和氨基。壳聚糖除具有多功能性、生物相容性、生物降解性，和低细胞毒性等优越性之外，还具有独特的跨细胞膜能力。但是由于壳聚糖只溶于稀酸和某些特定的溶剂，大大限制了它的应用。羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化反应后的形成的一类甲壳素衍生物，由于羧甲基壳聚糖上所含的-COO-降低了-NH³⁺的电荷密度，使得羧甲基壳聚糖的细胞毒性降低，具有比壳聚糖更好的细胞相容性；并且由于羧甲基壳聚糖溶于水，扩展了它的应用范围。

量子点(Quantum dots，QDs) 又称半导体纳米微晶体（Semiconductor nanocrystals），是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类半导体纳米粒子。量子点具有一般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子尺寸效应，具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等优越的荧光特性。正是基于量子点独特的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学以及蛋白质组学等研究中有着极大的应用前景。但是作为一种纳米材料，由于自身的物理化学性质和环境因素的影响，量子点在应用的过程中也表现出了一定的生物毒性效应，如何提高量子点荧光探针的稳定性和生物相容性是目前迫切需要解决的问题。

狗肾细胞通常用于流感病毒的分离与鉴定，1958年从正常的雄性考克斯班尼犬的肾脏建立了该细胞系。该细胞系是一种小犬肾细胞，其特点是细胞汇合后表达分化的上皮细胞特性，易于培养和传代。

发明内容

     本发明的目的在于针对目前各类量子点荧光探针在应用上的缺陷，提供了一种壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法，把羧甲基壳聚糖良好的细胞相容性和量子点优越的荧光性能结合起来，利用它们在水相通过自组装形成荧光探针，然后用于细胞标记。用荧光显微镜观察狗肾细胞的标记情况，用流式细胞仪检测培养皿中狗肾细胞的平均荧光强度。本发明操作简便，荧光效率高、生物相容性好、稳定时间长，荧光探针无细胞毒性，可用于细胞的长时间的观测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的基本构思是：根据羧甲基壳聚糖和CdTe量子点自身的特性，在水相通过自组装形成壳聚糖-量子点荧光探针，将该荧光探针与狗肾细胞在DMEM营养液中、于37℃、5%体积分数的CO₂细胞培养箱（下同）中共同孵育，壳聚糖-量子点荧光探针通过狗肾细胞的胞饮、胞吞或吞噬等方式进入细胞内部，与细胞中的蛋白质结合，达到对狗肾细胞进行荧光标记的目的。

一种壳聚糖-量子点荧光探针标记狗肾细胞的方法， 包括如下步骤：

1、配制0.0000025-0.001mol/L的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液（羧甲基壳聚糖-CdTe量子点自制，制备的简要过程如下：CdCl₂溶液和巯基乙酸溶液混合均匀后用NaOH 溶液调整其pH值为碱性，再向该溶液中加入新制备的KTeH₄溶液。将此混合液转入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控温的微波加热系统进行加热，反应完成后待溶液冷却至室温20-25℃，即可得到CdTe 量子点溶液。根据微波加热的温度不同，CdTe 量子点的荧光将会由绿色逐渐变化为红色。将不同颜色的CdTe 量子点与羧甲基壳聚糖溶液混合反应即可生成相应荧光的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点荧光探针，本领域的普通技术人员不付出任何创造性劳动均能制备）：根据羧甲基壳聚糖-CdTe量子点的浓度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基壳聚糖-CdTe量子点溶液于灭菌的10ml容量瓶中，加入高纯水（电阻率大于 18 MΩ·cm）定容，备用；所选用的壳聚糖-量子点荧光探针是由羧甲基壳聚糖和CdTe量子点在水相反应形成，具有良好的水溶性和生物相容性；