[发明专利]高通量基质辅助激光解析-质谱法筛查奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法(MALDI-MS)检测分析方法。 

技术背景

食品添加剂美化了食品外观、丰富了食品的类型和口味，同时也紧密影响着人们的生活。随着人类生活质量的提高，人们对食品安全的关注程度越来越高，食品添加剂的残留的检测也成为了一项国家法律所规定必须经过的流程，中华人民共和国食品安全法第二十八条规定“禁止生产经营下列食品：用非食品原料生产的食品或者添加食品添加剂以外的化学物质和其他可能危害人体健康物质的食品，或者用回收食品作为原料生产的食品(参见《中华人民共和国食品安全法》第二十八条)。三聚氰胺事件以后，人们谈“添”色变，开始质疑每一种食品添加剂的安全问题，国内各地相关部门也开始严厉打击各类违禁超标的食品添加。 

含有抗生素的牛奶对身体有害，一些奶农、奶站，为了达到原料奶的收购标准而使用“解抗剂”，“解抗剂”的主要活性成分为β-内酰胺酶，可以用来分解并掩蔽奶中残留的β-内酰胺抗生素。在乳制品生产加工之前，在含有抗生素的牛奶中只要添加解抗剂，就可以将不合格的有抗奶伪装成无抗奶。2009年3月9日，卫生部公布了《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》(卫监督发〔2009〕21号)，其中明确规定：乳及乳制品生产检查的重点是添加皮革水解物、三聚氰胺、β-内酰胺酶(解抗剂)、硫氰酸钠等非食品用物质及滥用增稠剂、香精、着色剂等违法行为，以及添加未经批准的进口食品原料或添加剂。正因为如此，GB6914-86《生鲜牛乳收购标准》修订版增加了11项检测指标，其中明确规定β-内酰胺类抗生素“不得”检出，并对检测方法和指标做出新规定(参见GB6914-86《生鲜牛乳收购标准》)。 

卫生部于2009年2月正式公布《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》(参见卫生部、食品整治办〔2009〕5号《食品中可能违法添加的非食用 物质名单(第二批)》)，其中明确认定β-内酰胺酶是属于违法添加的非食用物质，其作用就是掩蔽抗生素。综上所述，β-内酰胺酶作为生鲜乳中的一种违法添加物已经引起了学术界及政府主管部门的重视并制定了初步的管理方案。2007年中国药品生物制品检定所崔生辉等学者2006年5～8月间分3次从北京零售市场上随机采集了5个厂家生产的38份牛奶样品中有63.12％(24/38)检出了β-内酰胺酶(参见中国食品卫生杂志.2007，19，113-116)。由此引发了政府部门、检测机构对于β-内酰胺酶残留问题的关注，同时崔生辉等学者建立起了“杯碟法”β-内酰胺酶残留检测体系。根据抑菌圈的出现与否可以定性判定β-内酰胺酶的残留情况，并根据该方法的敏感度设定其检出限为4U/mL。以此为依据，2009年3月卫生部下达了“关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知”，并以“杯碟法”为标准建立了β-内酰胺酶的残留定性检测方案。虽然国家明文规定β-内酰胺酶属于不安全食品添加剂，但是，由于细菌耐药产生的内源性β-内酰胺酶有300多种，内源性、外源性β-内酰胺酶的区别鉴定检测技术尚未见报道。目前β-内酰胺酶的活力测定可采用《中国药典》(2005版二部附录XIB)收载的“青霉素酶活力测定法”，各检测机构正在研究的乳制品中β-内酰胺酶的检测方法一般是采用化学仪器分析高效液相色谱法或微生物法(参见国外医药.抗生素分册，1995，16，409-414)。马洁，李孝君，薛颖.利用酸度计检测奶制品中残留的β-内酰胺酶.该方法在磷酸缓冲溶液(PBS)和牛奶中，对β-内酰胺酶的检出限分别为10U/mL和15U/mL，同时得到米氏常数为0.0351mmol/L(参见化学通报.2009，72，370-373)。目前的研究结果表明市售的成品鲜牛奶依然可以检测到残留的β-内酰胺酶，这也说明巴氏消毒法不能有效对β-内酰胺酶灭活，食用这些奶制品依然具有风险。 

因此，发展建立简便、快速、准确和灵敏度高的检测方法，检测牛奶中非法添加的β-内酰胺酶类解抗剂，将对保障饮用牛奶的卫生和安全具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种奶类制品中β-内酰胺酶类解抗剂的高通量基质辅助激光解析-质谱法(MALDI-MS)检测分析方法。 

本发明是这样实现的：基于β-内酰胺酶使青霉素(Penicillin G，PEN G) 等抗生素中的β-内酰胺环发生开环反应，应用基质辅助激光解析-质谱平台对底物青霉素水解产物的定性和相对定量研究，高通量筛查和定量分析牛奶中的β-内酰胺酶类解抗剂。