[发明专利]基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗体的检测，特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。

背景技术

鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。

随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别是对有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血清的ELISA方法和胶体金免疫层析法已被大量报道。但是，基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法尚未报到，重组UL51蛋白是否与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应、是否可用于鸭瘟病毒抗体的检测尚需证实。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的胶体金免疫层析试纸检测鸭瘟病毒抗体，所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化并发酵培养，收集到了大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀；为保证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，接着对重组UL51蛋白进行了纯化；且将纯化的蛋白再依次分步梯度透析，以降低尿素浓度使该蛋白恢复其空间结构，复性后的蛋白具有较好的抗原性；同时，用Western blotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定重组UL51蛋白标记浓度、兔免疫球蛋白的包被浓度及金标垫的包被参数后，制备了胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭瘟病毒抗体的特异性、灵敏性较高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

进一步，所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

本发明的目的之二在于提供所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，该方法简单实用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述胶体金免疫层析试纸的制备步骤具体步骤为：

a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制：将浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；

b金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；

c胶体金免疫层析试纸条的组装：分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；