[发明专利]一种海洋链霉菌属菌株及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于海洋微生物领域，具体设计一种由海洋链霉菌属菌株(Streptomyces sp.HH-1)制备的抗细菌群体感应活性提取物及其应用。

背景技术：

群体感应(Quorum Sensing，QS)是细菌根据自身细胞密度变化进行自我协调的一种群体行为。细菌利用信号分子，或称为自诱导物(autoinducers，AI)作为相互交流的“语言”，细菌在繁殖过程中不断将信号分子分泌到胞外，并检测其浓度从而感知其群体密度的变化；当其密度达到某个阈值时，就会启动某些基因的表达。群体感应系统广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中，控制着包括生物被膜形成、毒素产生、致病基因表达、胞外多糖生成等一系列的细菌行为和表型，对病原菌致病过程起决定性的作用。大量文献表明缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低，因此，通过干扰细菌群体感应系统来控制病原菌致病是一个非常有效的策略，并且以细菌的群体感应系统为靶标筛选的抗菌药物，与那些传统的抗生素药物的作用机制完全不同，只抑制细菌群体感应调控的致病行为，不影响细菌的生长，理论上不会产生细菌耐药性。

目前，人们利用不同的筛选模型，发现了furanone(J EMBO，2003，22(15)：3803-3815.)、4-NPO(J Bacteriol，2005，187(5)：1799-1814)、solenopsinA(Infect Dis，2008，198(8)：1198-1201)等化合物具有细菌群体感应抑制作用。QSIS2筛选模型(J Bacteriol，2005，187(5)：1799-1814)是利用受铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应系统(Nature，2000，406：959-964)调节的下游基因lasB的启动子，和蔗糖致死基因SacB为报告基因构建而成；在有蔗糖底物存在的情况下，信号分子3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)和lasR受体蛋白结合，启动lasB启动子下游致死基因SacB的表达，若存在群体感应抑制因子如阳性对照物C30(furanone)，致死作用则会得到补救；紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)是一种革兰氏阴性细菌，当自身细菌细胞密度的增加达到一定临界浓度时，向环境中释放的信号分子己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)能与胞内转录调节蛋白CviR结合，启动紫色菌素等群体感应相关基因的表达；所以紫色杆菌常作为一种简便、直观的群体感应抑制因子筛选模式菌株(Microbiology，1997，143(12)：3703-3711)。

海洋微生物是生物活性物质的巨大宝库。特殊的海洋环境赋予海洋微生物以新的活性，高盐度、高压力、低温及特殊的光照等复杂海洋生态环境可能使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上具有更大的多样性，产生不同于陆地来源的特殊产物。本发明是从海洋软体动物体内分离内共生放线菌，利用QSIS2筛选模型和TTC活菌染色的方法得到一株具有细菌群体感应抑制活性的链霉菌HH-1，并且其发酵液提取物能够抑制紫色杆菌群体感应系统调控的紫色菌素的产量。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种由海洋Streptomyces sp.HH-1发酵制备的提取物，该提取物具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统的活性，并且能够降低致病菌毒力因子的产生，减弱致病菌的耐药性。

本发明所述的活性提取物的获得方法主要有：海洋Streptomyces sp.HH-1分离与提取物的制备两个步骤。取活化后的海洋Streptomyces sp.HH-1，接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵结束后用等体积乙酸乙酯萃取3次，将萃取液过滤，真空低温浓缩至干，得到褐色浸膏，称取适量褐色浸膏用甲醇溶解后用于生物活性测定。

本发明所涉及的海洋Streptomyces sp.HH-1制备的提取物具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌感染的作用；该提取物在0-200mg/mL浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的生长；但能显著降低紫色杆菌紫色菌素的生成，且该提取物的群体感应抑制作用呈浓度依赖性；该提取物在0-500mg/mL的范围内对筛选模型QSIS2的生长不产生影响。

本发明与现有技术相比，具有海洋Streptomyces sp.HH-1菌株发酵培养条件简单，其制取提取物的工艺过程简单易控，产量高，制备的提取物抑制细菌群体感应作用明显等优点。

附图说明：

图1为本发明的活性提取物的活性筛选图。

图2为本发明的提取物对筛选模型QSIS2生长曲线测试图。