[发明专利]筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤预防领域，具体涉及一种快速筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法。

背景技术

化学预防剂是指可对癌症进行预防、延缓以及逆转其发生发展过程的一类天然或人工合成的化合物。专用于化学预防剂体外检测的方法较少，已有的方法是将抗氧化反应元件（ARE）、TK启动子及绿色荧光蛋白（GFP）基因（报告基因）重组于HepG2细胞，使GFP的表达量在ARE的调控之下。用溴乙啶（EB）染色校正细胞数对检测结果的影响，直接检测GFP和EB荧光强度，通过相对荧光强度甄别或检测化学预防剂。这种方法避免了用酶做报告基因时测酶活性需要破坏细胞壁，不同的破壁方法对实验结果影响较大，酶活性受时间、温度、pH、菌液浓度的影响较大，耗时长等缺点，但该方法单个ARE调控无法凸显化学预防剂的作用效果，且EB具有致癌性，危害人体健康，污染环境。

发明内容

为了解决现有筛选方法耗时长，不敏感，有污染的不足，本发明提供了一种快速筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，用于肿瘤预防药物筛选，有效地解决了问题。

本发明采用的技术方案是：

一种筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于是一种转基因细胞，该转基因细胞带有ARE（抗氧化反应元件）、TK启动子、EGFP（增强绿色荧光蛋白）以及DsRed（红色荧光蛋白），EGFP的表达受ARE的调控。

作为本发明的一个具体的技术方案，所说的转基因细胞是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed，即在HepG2细胞中重组整合有ARE、TK、EGFP和DsRed，且EGFP的表达受ARE的调控。结构特征如图1所示，传感器中主要由2种荧光蛋白构成：（1）EGFP（增强绿色荧光蛋白）表达由TK启动子驱动，且在ARE（抗氧化反应元件）的调控之下；（2）DsRed（红色荧光蛋白）表达由CMV启动子驱动。

上述所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器的构建方法是：

1）利用基因工程技术构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的EGFP报告载体；

2）将红色荧光蛋白DsRed及其启动子片段插入步骤1）的报告载体，构建双信号报告载体；

3）将步骤2）的报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。

绿色荧光蛋白（GFP）是来自水母的一种天然荧光蛋白，红色荧光蛋白（DsRed）是从珊瑚虫中分离出的绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白，它们在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光，因此，具有活体、原位、实时表达的特点。这样可将ARE与GFP相串联，使GFP的表达处于ARE的调控之下，再插入红色荧光（DsRed）蛋白及其启动子片段，构建成一种双信号转基因细胞传感器，其GFP的发光程度与化学预防剂的作用程度具有量效关系。当化学预防剂作用于双信号转基因细胞时，EGFP基因的表达量与化学预防剂的作用强度具有一定的剂量效应关系，通过测定EGFP和DsRed发光强度获得的相对发光强度可以反映化学预防剂的作用强度或快速筛选某些化学预防剂。该方法用4个ARE重复序列调控，可敏感显示化学预防剂的作用效果；用GFP为报告基因，可克服用酶作为报告基因不经济、可比性差等缺点，也省却了对细胞进行破壁等繁琐步骤；以DsRed为内参照来校正细胞数、细胞状态对结果的影响，可克服EB污染环境和危害人体健康等缺点。直接检测红绿荧光强度，能方便、快速、定性、定量地评价化学预防剂的诱导效果。

附图说明

图1 本发明双信号转基因细胞传感器示意图。

图2 本发明双信号转基因细胞传感器工作原理图。

图3 是p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo在HepG2细胞中的瞬时表达。

图4 是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed细胞的表达。

图5 是质粒p4ARE-TK-GFP/neo结构示意图。

图6 是阳性受试物PDTC和tBHQ剂量效应关系。

具体实施方式

文中所用到的质粒或细胞：

HepG2：购自中科院上海细胞研究所。

p4ARE-TK-GFP/neo：本室构建保存；结构如图5。(徐海荣，卜平，李湘鸣.真核表达载体p4ARE-TK-GFP/neo的构建及其表达.      细胞与分子免疫学杂志,2009,25(11):1008-1012.)申请人承诺向公众提供20年。