[发明专利]人成纤维细胞生长因子-21的聚乙二醇化学修饰物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质修饰物领域，具体而言，本发明涉及用聚乙二醇修饰的人成纤维细胞生长因子-21的修饰产物及其制备方法和应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，简称为FGF）-21是FGF家族的一个新成员，是一种分泌蛋白，最早从鼠胚胎中分离出来。人的FGF-21cDNA编码209个氨基酸，与鼠的FGF-21的氨基酸序列大约有75%的同源性。迄今为止FGF-21的生物活性作用方式主要体现在降低血糖、改善血脂方面（降低血糖的同时不导致低血糖），可用于治疗Ⅱ型糖尿病，并且对药物引发的早期肝癌有一定的治疗作用，另外在胚胎发育中的也能起到一定作用。

FGF-21的广泛的生物学活性表明其在医疗上有广泛的应用前景。但大量研究和临床实践表明FGF-21存在稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷。因此如何提高FGF-21稳定性、延长其体内半衰期成为一个重要的课题。因此，美国礼来公司等利用聚乙二醇(polyethylene glycol，简称为PEG)来对FGF-21进行修饰，用以提高FGF-21稳定性、延长其体内半衰期（可参见WO2009020802A、WO2008011633A、WO2006091727A、WO2006050247A、WO2005091944A等）。但是这些技术多数属于定点PEG化，甚至为了PEG化而突变FGF-21蛋白本身的氨基酸残基，除了部分实验验证的意外，将导致突变后的FGF-21蛋白是否能具有原有功能的不可预料性。

然而，非定点PEG化蛋白质尽管相对于定点PEG化蛋白质的制备方式简单些，成本通常也较低，但是，PEG通过活性基团与蛋白质的末端或侧链连接，理论上将造成蛋白质本身折叠构型的改变，因此，该蛋白质经PEG化是否仍旧具有原有蛋白功能并起相应作用，是难以预料的。Harris等（Clinical Pharmocokinetics，2001，40（7）：539-551）明确指出，PEG的大小、几何特征和连接位点等均对最终PEG化的产物构成关键的影响，有众多因素可能影响蛋白质的PEG化，包括但不限于：

      1，不同的氨基酸序列所能提供的连接位点数目不同；

      2，蛋白质结构可能会将连接位点包埋在内部，从而在一定条件下的PEG化将使蛋白质结构翻转；

      3，蛋白质结构可能会使PEG在连接位点处形成空间位阻，造成蛋白质折叠的不可逆转变；

      4，可能在PEG化后破坏蛋白质的配体-受体结合界面；

      5，不同的PEG化模式可能导致不同程度的抗原性；

      6，不同的PEG化模式可能导致不同的清除率；

      7，不同的清除机制需要不同程度的PEG连接和/或不同的PEG连接位点；

      8，不同的PEG化模式可能导致不同的半衰期以满足蛋白质在生理环境下发挥其功能的要求。

因此，蛋白质的PEG化是不可预测的。另外，Clark等（Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（36）：21969-21977）也公开了PEG化后蛋白质功能的不可预测性的例证。

因此，本发明人经过长期努力，发现某些FGF-21的非定点PEG化模式将导致FGF-21本身的蛋白活性极大降低，甚至蛋白功能消失，而必须采用一些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式才能具有原有蛋白功能，不大幅降低原有蛋白活性，从而可以调节血糖、血脂代谢，用于实际的II型糖尿病等治疗用途中。当然，这些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式仍旧保留了PEG化本身的优点，如热稳定性好、抗酶解能力高、体内半衰期长、免疫原性低和安全性好等。另外，这些经过实验验证的FGF-21的非定点PEG化模式，产物均一性好、分离纯化工艺简单，尤其还可以方便地回收未与PEG缀合的FGF-21。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种热稳定性好、抗酶解能力高、体内半衰期长、免疫原性低和安全性好的FGF-21的修饰物，其不大幅降低原有未修饰的蛋白活性，从而具有FGF-21蛋白功能，可以调节血糖、血脂代谢。本发明另一个要解决的技术问题还在于提供上述修饰物的制备方法，其产物均一性好、分离纯化工艺简单，尤其还可以方便地回收未与PEG缀合的FGF-21。