[发明专利]一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体的说是一种水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用。

背景技术

随着捕捞资源的急剧衰减，海水养殖已成为国际社会为满足人类日益增长的蛋白质需求普遍采纳的主要举措。根据世界粮农组织(FAO)数据，自2000年以来水产品的增长主要来自海水养殖。近年来，我国的海水养殖业取得了长足发展，一跃进入世界先进行列。按2007我国渔业统计年鉴资料显示，2007年我国水产品总产量4747.52万吨，养殖产量3278.33万吨，占总产量的69％。海水养殖业已成为我国国民经济的重要组成部分，是促进农村经济发展、调整农业产业结构、增加农民就业和收入的有效途径之一，对建设和谐社会具有重要作用。

然而海水养殖业多年来集约式、工厂化的快速发展，引起养殖环境不断恶化，多种养殖品种的病害频繁发生。目前常见病害就有300种以上，涉及的病原种类超过200多种，导致每年约有1/10的养殖面积受到病害侵袭，年损失产量占养殖总产量的15％～30％，直接经济损失上百亿元，并且呈上升趋势。病害频繁发生以及控制难度的增加已经严重影响到农民养殖的积极性。由于安全有效的生物渔药的严重匮乏以及利益驱动，在养殖中普遍存在大量使用化学消毒剂、抗生素、不安全添加剂等不良问题，结果形成了比较严重的药物残留的问题，影响水产品质量的安全，对消费者的健康构成了直接威胁，严重影响到水产品的对外贸易和我国的国际形象。同时还造成了病原微生物耐药性增强及养殖环境恶化。病害已成为当前水产养殖业最为突出和亟待解决的问题，如有关的科学问题不能得到有效的解决，不仅海水养殖业持续发展受到阻碍，而且将直接威胁到现有产业的生存。

为控制病害的频发，新型生物渔药和饲料添加剂的开发显得至关重要。在此方面，研究的主要进展集中于鱼类等的高效疫苗的研制和开发上。疫苗的广泛使用，有效地抵抗了多种重要水产病原的感染，大大减少了抗菌素等药物在养殖鱼类方面的使用量。挪威、美国、加拿大、荷兰等国鱼用疫苗产业化程度高、市场成熟，培育出众多从事鱼用疫苗开发的跨国公司，如Alpharma、Aqua Health、Intervet、Bayotek等。然而虾蟹类无脊椎动物因缺少获得性免疫体统，疫苗是无法应用于这些动物的病害防治，其渔药的制备主要利用生物活体或生物代谢过程中产生的具有生物活性的物质或从生物体提取的物质作为防治水产动物病害的药物。虽然目前通过基因工程、发酵工程、生化制备工程技术等手段，在一些微生态环境改良剂(光合细菌、消化菌、放线菌及其它生物活性剂等)、免疫促进剂(肽聚糖、葡聚糖、多肽等)、抗微生物制剂(干扰素、抗菌肽、凝集素、抗病毒肽、溶菌酶等)、生物防治剂(病毒制剂、噬菌体制剂、微生物制剂等)等的研制方面显示出广阔的应用前景。但整体而言，针对海洋无脊椎动物病害控制的有效药物或饲料添加剂的研究进展仍十分缓慢。

发明内容

本发目的在于提供一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸：特异的免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的制备方法：将人工设计合成的CpG寡聚核苷酸序列与pUC57质粒相连，而后转化入大肠杆菌DH5α菌株中，37℃，200-220rpm震荡培养4-6h；将上述菌液按1∶100的体积比接种与发酵培养基中，发酵培养7-9h；收集富含CpG寡聚核苷酸的发酵培养物于STET缓冲液中悬浮菌体并震荡搅拌，而后在每毫升菌体重悬液中加入80-100μg搅拌均匀于36.5-37.5℃中水浴20-30min，随后将裂解液于沸水浴中加热10-15min，沸水加热后冷却至室温，离心取上清；将上清加入到上清液0.6倍体积的预冷的异丙醇中，室温下沉降离心沉淀，即得具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs。