[发明专利]用于治疗缺血性脑血管疾病的制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗缺血性脑血管疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：

步骤1).从健康人血液中通过密度梯度离心的方法或白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；

步骤2).培养单核细胞以获得EPC细胞；

步骤3).在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；

步骤4).对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得治疗缺血性脑血管疾病的制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液的来源可以是自体来源，或异体来源，或通过血库购买的健康人白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。

3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞以获得EPC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(可由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；培养基中另含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白；培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度为5％。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得EPC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养2-4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×10⁵至2×10⁵个细胞的密度重新培养3-7天，获I型EPC细胞；

方法②：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×10⁵至2×10⁵个细胞的密度重新培养3-7天，获II型EPC细胞；

方法③：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×10⁵至2×10⁵个细胞的密度重新培养10-21天，获III型EPC细胞；

方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34⁺的单核细胞亚群，将此CD34⁺单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×10⁵至1×10⁶个细胞的密度培养2-6天，获IV型EPC细胞。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的在特定条件下培养EPC细胞的方法为：将步骤2)所获得的EPC细胞置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、EBM、EBM-2、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白。

7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白。