[发明专利]一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及羊驼副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis，MAP)的hed(Host expression dependent)蛋白间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

羊驼原产于南美洲安第斯山脉，与驼羊、骆马、原驼共同属于美洲驼属，被称为南美小型驼。驼绒有22种天然色，是高级毛纺原料，具有“软黄金”之称；其皮可制成地毯、被子等；其肉蛋白质含量高，味道鲜美。羊驼是一种很有市场前景的经济动物，我国山西于2000年首次从澳大利亚引进羊驼，随后在新疆维吾尔自治区等地区也先后引进羊驼，为我国农牧民增收增添了新的亮点。

羊驼副结核病是由副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis，MAP)引起的羊驼的一种慢性传染性肠炎，羊驼价格昂贵，一旦羊驼牧场被大面积传染该病，造成的经济损失将是巨大的。副结核病的检测常采用皮内变态反应、补体结合试验等，但是皮内变态反应需要检测活动物，且灵敏度较低；补体结合试验灵敏度较低，且检测很不方便。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法，该检测方法特异性高，灵敏度高，方便，快速，适合大规模样品检测。

本发明提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂：

(1)、副结核分支杆菌重组hed蛋白；

(2)、羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。

所述试剂盒还可以包含酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、显色液配制原料和终止液；

所述包被液是浓度为1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7.5；

所述封闭液是质量浓度为2％的明胶溶液；

所述PBST的组成是：Na₂HPO₄ 2.9g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，Tween-20体积浓度为0.05％，其pH为7.4；

所述显色液配制原料包括：①由Na₂HPO₄·12H₂O 18.408g/L，柠檬酸5.106g/L组成的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0；②邻苯二胺；③体积浓度为30％的H₂O₂水溶液；

所述终止液是浓度为2mol/L的H₂SO₄溶液。

本发明还提供采用上述试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体的方法，按如下步骤：

(1)、包被：副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液稀释至3.75μg/mL，于酶标板各孔中分别加入100μL，4℃包被过夜，用PBST洗涤5次；

(2)、封闭：每孔加入300μL封闭液，4℃封闭过夜，用PBST洗涤5次；

(3)、加入待检样品：以PBST分别将阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清按体积1∶50稀释，每孔中加入100μL，37℃孵育60min，用PBST洗涤5次；

(4)、加入辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A：用PBST将辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A作1∶5000稀释，每孔中加入100μL，37℃孵育60min，用PBST洗涤5次；

(5)、配制并加入显色液：临显色之前向所述磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中加入邻苯二胺，使邻苯二胺浓度达到0.4g/L，然后加入所述的H₂O₂水溶液0.15mL，即获得显色液；每孔加入该显色液100μL，37℃避光孵育15min；

(6)、终止：每孔加入100μL终止液终止反应，酶标仪测定每孔的OD_490nm值；

(7)、判定：待检血清孔的OD_490nm值≥阴性对照血清孔的OD_490nm值+0.24，判为阳性；反之判为阴性。

本发明提供的检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，引入了特异性强、且高效表达的副结核分支杆菌hed蛋白，用它作为检测抗原，直接检测羊驼抗副结核分支杆菌抗体，具有良好的特异性和灵敏度。用本试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体方法简便、快速且准确，适合大批量样品检测。

具体实施方式

实施例1副结核分支杆菌重组hed蛋白的制备

1.引物设计