[发明专利]一种朊蛋白异构体单克隆抗体基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种特异性识别和结合朊蛋白异构体的单克隆抗体基因，以及该基因制备的单克隆抗体。 

本发明还涉及所述单克隆抗体在朊蛋白异构体的定性及定量检测，以及制备朊病毒病的诊断试剂和治疗药物方面的用途。 

背景技术：

朊蛋白异构体(PrPSc)是引起朊病毒病(prion disease)病理改变和可传播性的主要原因。朊蛋白异构体PrPSc也是朊病毒病的标志物，是最重要的朊病毒病感染性因子，对神经元的毒性最强。 

针对朊蛋白异构体PrPSc分子的免疫疗法来治疗或预防朊病毒病，是治疗的一个重要途径。现有技术的方法目前还不能特异性识别朊蛋白异构体，因此免疫效果不理想。 

因此需要有特异性识别和结合朊蛋白异构体，而不识别正常朊蛋白的单克隆抗体。 

发现对朊蛋白异构体具有特异性的单克隆抗体基因，是研制朊蛋白异构体的单克隆抗体的关键。 

发明内容：

本发明的目的是发现特异性识别和结合朊蛋白异构体(PRPSC)的单克隆抗体基因，并以此制备特异性针对朊蛋白异构体的单克隆抗体。 

本发明的另一目的是将所制备的朊蛋白异构体单克隆抗体用于朊蛋白异构体的定性及定量检测，可用于制备朊病毒病的诊断试剂和治疗药物。 

本发明应用5’RACE技术通过基因特异引物和锚定引物成功的从培养的抗朊蛋白异构体杂交瘤细胞APR3中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可以正确编码小鼠抗体可变区。基于上述已经克隆到的APR3抗体轻链、重链可变区基因，采用基因重组的方法，构建和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体，以用于朊病毒病的诊断和治疗目的。 

制备上述单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为APR3。已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201077。中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉武汉大学。 

本发明内容详述如下： 

本发明制备了抗朊蛋白异构体单克隆抗体，取名为APR3。由北京交通大学生命科学与生物工程研究院建立和保存。本发明人发现了抗朊蛋白异构体的单克隆抗体APR3重链和轻链可变区基因，重组后可表达出特异性识别和结合朊蛋白异构体的抗体活性片段。 

单抗APR3可以特异性识别脑组织的朊蛋白异构体PrPSc。APR3对PRPSc的结合能力高于其宿主蛋白PrP。其亚类为IgG₁。用于ELISA、蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1∶10⁴、1∶2,000。 

本发明人使用5’RACE的方法克隆到抗朊蛋白异构体单抗APR3轻链、重链可变区基因。根据抗体恒定区CH-1区的最保守的一段序列设计引物，进行反转录，在cDNA产物的5’端加上Poly(C)尾巴，然后使用针对多聚脱氧核苷酸尾巴设计的锚定引物与基因特异性引物通过PCR方法将目的基因扩增出来。序列分析表明，APR3抗体轻链和重链可变区序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达90％与91％。可以确定所得到的序列为抗体轻链和重链可变区序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。 

APR3重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性抗朊蛋白异构体单抗的杂交瘤细胞株中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为450bp，所述的轻链可变区基因全长为429bp，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合朊蛋白异构体的抗体活性片段。 

所述抗朊蛋白异构体单克隆抗体APR3的重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：4所示。其中： 

SEQ ID NO：1是抗朊蛋白异构体单克隆抗体重链可变区DNA序列； 

SEQ ID NO：2是抗朊蛋白异构体隆抗体重链可变区氨基酸序列。 

SEQ ID NO：3是抗朊蛋白异构体单克隆抗体轻链可变区DNA序列； 

SEQ ID NO：4是抗朊蛋白异构体单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。 

抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因的克隆。 

分泌产生上述抗朊蛋白异构体单克隆抗体的细胞株为采用传统的骨髓瘤与脾细胞融 合的方法获得的一株鼠源性抗朊蛋白异构体单抗杂交瘤细胞株，命名为APR3，其抗原为朊蛋白多肽片段，其分泌的抗体分子亚型为IgG1。 

本发明在制备抗朊蛋白异构体单克隆抗体及其性质和功能鉴定中进行了如下实验： 

1、抗体制备及性质的鉴定