[发明专利]一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，制备该重组蛋白可应用于预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗，属于农业生物技术领域。

背景技术：

减蛋综合症(Egg Drop Syndrome，EDS)是由减蛋综合症病毒(EDSV)引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特症的传染病(殷震，1982)。1976年被Van Eck首次报道，现已成为世界范围内引起产蛋损失的主要原因之一；并于1977年根据其病毒粒子形态、化学组成、及复制特点等归为血凝性禽腺病毒。该病毒被命名为Ⅲ群禽类腺病毒，是此群中的唯一成员，并且确定了其完整的EDSV核苷酸序列(McFerran等，1997)。我国于1986年-1990年证实许多鸡场EDS-76血清阳性，1992年由李刚首次分离到病毒，之后，从发病鸡群和其他禽类中分离到多株病毒(Prya等，2001)。目前该病已经成为世界范围内引起产蛋损失的重要疾病之一，给养禽业造成了巨大的经济损失。本病可使产蛋率下降10％-30％，最高达41％，蛋的破损率达38％-41％，不同年龄的鸡均可感染，6-8月龄母鸡处于发病高峰期，既可水平传播，又可垂直传播，给养鸡业造成严重的经济损失。

目前，本病尚无有效的治疗方法，只能从加强管理、免疫、淘汰病鸡等方面进行防治。在发病时，如有必要也可给抗菌药物，以防混合感染或继发感染。预防本病的关键是注射疫苗。目前对于鸡减蛋综合症的防治措施主要是使用减蛋综合症的灭活疫苗。然而，用该病毒进行接种，作为灭活疫苗或减毒株，有很多的缺点。一方面，一些减毒活疫苗仍保留有一定的毒力，并且对于强毒株展示出的抗原覆盖效果是有区别的。另一方面，灭活疫苗灭活剂对病毒抗原有影响，而且对不同的抗原成分影响不同。

腺病毒是(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，其衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)，其中基底由纤维蛋白的N-末端组成，而头节区则由纤维蛋白的C-末端组成。纤毛的头节区可与动物细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。因此，纤维蛋白的C-末端区域为其抗体封闭后，病毒就丧失了其感染细胞的能力。

本发明从一株减蛋综合症病毒的基因组中克隆了其纤维蛋白C-末端编码基因，并建立了获得该基因编码重组蛋白的方法，为减蛋综合症基因工程疫苗的研制提供了一种新的途径。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有灭活疫苗生产技术的缺点，旨在提供一种利用DNA重组技术制备EDSV关键抗原的方法。利用该方法可以快速、简便、制备大量重组蛋白，可应用于家禽减蛋综合症的预防。

为了实现上述发明目的，本发明的重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法为：首先利用PCR技术从EDSV基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌(E.coliBL21(DE3))后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。

步骤一，纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析，按照如下步骤操作：

根据分离病毒的基因组序列设计一对引物，

引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3’，

引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3’。

采用酚抽提法从感染EDSV的鸡血细胞中提取总DNA，以该DNA为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-EDS，转化大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒，利用双脱氧链终止法进行序列测定。从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列1所示的核苷酸序列。

序列1

ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA CGGATTTTCA GGTGACAGAA