[发明专利]一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法

权利要求书

1.一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于：首先利用PCR技术从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。

2.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于所述的纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析按照如下步骤操作：根据分离病毒的基因组序列设计一对引物：引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3’，引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3’，采用酚抽提法从感染减蛋综合症病毒的鸡血细胞中提取总DNA，以该DNA为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-EDS，转化大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒，利用双脱氧链终止法进行序列测定。

3.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于所述的表达载体与工程菌的构建按照如下步骤操作：将pMD-18T-EDS与pET-15b用NdeI/Xho I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5.7kb的pET-15b，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-15b-EDS；将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后SDS-PAGE电泳分析。

4.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的纯化按照如下步骤操作：挑取工程菌单菌落接种于LB液体培养基，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1∶20的比例倒入LB液体培养基，37℃恒温振荡培养3h；然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度为5mmol/L，37℃恒温振荡培养4h；将培养物低温冷冻离心，8000rpm，20min；弃上清，加入结合缓冲溶液悬浮菌体，进行超声波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即包含体；将包含体中加入W/V为2％的Triton X-100，用搅拌器搅拌，超声破碎，搅拌器继续搅拌，低温冷冻离心8000rpm，30min；再分别用W/V为2％，2.2％，2.4％，2.5％的Triton X-100按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入结合缓冲溶液配制的浓度为8mol/L的尿素，用磁力搅拌器搅拌，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清；将尿素溶解包含体的上清上结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素平衡的Ni敖合树脂柱，先用10倍柱床体积的结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用洗脱缓冲溶液配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液，流出液于4℃对蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥；其中，结合缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑；洗涤缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，100mmol/L咪唑；洗脱缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑；所述LB液体培养基含氨苄青霉素浓度0.1g/L。

5.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原是纤维蛋白C-末端，具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于利用该方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒的鸡血清具有明显的免疫反应。