[发明专利]抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂板及制备方法，具体地是一种抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为犬、猫等动物。典型症状为恐水症，又称：恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100％。随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们迫切希望了解宠物犬接种狂犬疫苗后犬只是否获得保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多数的人狂犬病是与人类密切接触的带毒犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。

目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。用于实验动物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，也有一定的研究和报道。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。ELISA方法虽然灵敏度高，但容易出现假阳性结果。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层析法刚好可以避免以上几种检测方法的缺点。该方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。中国专利公开号为CN1963509的专利申请公开了一种狂犬病毒保护性抗体胶体金检测试纸条，该法采用包被糖蛋白，标记狂犬病毒的双抗原夹心法。中国专利公开号为CN101029894的专利申请公开了一种动物狂犬病毒抗体双抗原夹心胶体金检测试纸及制备方法，该法采用包被狂犬病毒，标记GP/NP的双抗原夹心法。中国专利公开号为CN101042401的专利申请公开了一种犬抗狂犬病毒抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法，该法采用包被糖蛋白，标记二抗的间接检测犬抗狂犬病毒IgG的方法。中国专利公开号为CN1326101A的专利申请公开了一种胶体金免疫层析狂犬病病毒抗体检测试剂条及制备方法，该法采用包被狂犬病毒，标记抗人二抗的间接检测人抗狂犬病毒IgG的方法。

以上文献资料涉及的方法存在着检测受种属限制和蛋白纯化及复性困难的缺点。

发明内容

本发明的目的为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，而提供一种抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法。本发明采用金标记蛋白A(SPA)做探针，包被狂犬病毒和抗SPA抗体的间接法检测抗狂犬病毒IgG抗体，可供多种动物和人的抗体检测。本发明的试剂板检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。

本发明的技术方案为：

抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收区1、金标记蛋白A(SPA)区2、固相化抗原、抗体区3和吸水区4，样品吸收区1铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上铺设玻璃纤维膜，且玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜7和硝酸纤维素膜6；硝酸纤维素膜6上包被检测线31和对照线32，其中检测线31侧贴有金标探针聚酯膜7，对照线32侧贴有吸水滤纸8，其特征在于：检测线31包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为0.1-10μg蛋白；对照线32包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为0.1-10μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为1-10μg/ml。

抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)狂犬病毒纯化抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培养5～6天后，每隔3天连续收取培养液上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000rpm离心30分钟去沉淀，上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒纯化抗原；