[发明专利]一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及小油桐转基因技术，具体涉及一种通过农杆菌介导基因转化技术获得小油桐转基因植株的方法方法。

背景技术

小油桐(Jatropha curcas L.)又名小桐子、麻疯树、膏桐等，属大戟科(Euphorbiaceae)麻风树属(Jatropha)多年生灌木或小乔木，广泛分布于热带和亚热带地区，是一种多用途的树种，在生物柴油、医药开发、生物农药和肥料等方面具有良好地应用前景。其种子含油率一般在30～40％，是目前国际上公认的最具发展潜力的能源植物之一。但小油桐目前在世界各地种植的产量普遍太低，无法满足生物柴油产业发展对原料的大量需求。由于木本植物的世代周期较长，采用常规的育种技术难以在较短的时间内选育出高产的新品种，因此，利用转基因技术提高小油桐的产量就具有重要的现实意义。

近几年来，国内外对小油桐的遗传转化进行了初步的研究，虽然已可以通过小油桐多种外植体，如真叶、叶柄、子叶、下胚轴和节等获得小油桐的再生植株，但这些再生体系仍未能转变为高效的转化方法。Li等(2008，Plant CellTissue and Organ Culture，92：173-181)以子叶作为外植体通过农杆菌介导的转化方法，用除草剂草铵膦作为筛选试剂首次获得了转基因小油桐，但转化效率不高。He等(2009，Silvae Genetica，58：123-128)和Mazumdar等(2010，South African Journal of Botany，76：337-344)尝试用硫酸卡那霉素和潮霉素(Trivedi et al.，2009，International Journal of Agriculture Sciences1：11-20)作为筛选试剂，但只获得了抗性的愈伤，无再生的转基因植株。最近，Purkayastha等(2010，Biologia Plantarum，54：13-20)用基因枪的方法也获得了再生的转基因植株。但基因枪轰击存在一些问题，如外源基因往往是多拷贝随机整合到受体基因组中，可能发生多种方式的重排，易造成转录或转录后水平的基因沉默，产生嵌合体等。农杆菌介导的转化方法是外源基因自然转移过程，外源基因能有效地整合到植物细胞染色体上，且大多数是单一位点整合，遗传稳定性较好。探索一种既能利用农杆菌介导的基因转化方法的优点又能提高小油桐转化效率的方法，对小油桐的转基因研究将起到很大的促进作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有小油桐转基因技术的不足，提供一种以小油桐成熟种子的子叶为转化受体、通过农杆菌介导的转化方法获得小油桐转基因植株的方法。该方法采用含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌转化小油桐子叶，获得转基因植株，为生产上转化其他目的基因、获得转基因的小油桐优良株系提供有效的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：以小油桐成熟种子的子叶切除其基部的1/3～1/4后的材料作为农杆菌感染的受体，转化受体与农杆菌共培养后先接种在无筛选剂的培养基上进行愈伤诱导培养4周后，再继代到选择培养基上筛选抗性芽，以硫酸卡那霉素作为筛选剂，通过筛选获得抗性芽，继代培养获得抗性植株，经分子检测，获得转基因小油桐植株。

一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，包括以下步骤：

1、种子灭菌和外植体准备：

取小油桐成熟的种子，剥去外种皮，置无菌水中浸泡10～12小时后用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水冲洗3～4次，放置在无菌滤纸上除去多余的水分；取出胚，切除胚轴端1/3～1/4长度的子叶，剩余子叶部分作为外植体备用；

2、外植体与农杆菌共培养和转化

挑取含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌单克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L链霉素的YEP液体培养基中进行活化培养，在28℃下200rpm振荡培养12小时，转接并二次活化农杆菌，菌液浓度至OD₆₀₀＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清，用无菌液体MS基础培养基悬浮菌体至OD₆₀₀＝0.4待用；