[发明专利]一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：以小油桐成熟种子的子叶切除其基部的1/3～1/4后的材料作为农杆菌感染的受体，转化受体与农杆菌共培养后先接种在无筛选剂的培养基上进行愈伤诱导培养4周后，再继代到选择培养基上筛选抗性芽，以硫酸卡那霉素作为筛选剂，通过筛选获得抗性芽，继代培养获得抗性植株，经分子检测，获得转基因小油桐植株。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)种子灭菌和外植体准备：

取小油桐成熟的种子，剥去外种皮，置无菌水中浸泡10～12小时后用75％的酒精灭菌30秒，无菌水冲洗2～3次，然后用0.8％～1.0％次氯酸钠溶液处理10分钟，无菌水冲洗3～4次，放置在无菌滤纸上除去多余的水分；取出胚，切除胚轴端1/3～1/4长度的子叶，剩余子叶部分作为外植体备用；

(2)外植体与农杆菌共培养和转化

挑取含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌单克隆于含有50mg/L卡那霉素和25mg/L链霉素的YEP液体培养基中进行活化培养，在28℃下200rpm振荡培养12小时，转接并二次活化农杆菌，菌液浓度至OD₆₀₀＝0.4～0.8，在4℃下4000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清，用无菌液体MS基础培养基悬浮菌体至OD₆₀₀＝0.4待用；

取制备好的子叶外植体置上述农杆菌菌液中，在28℃，150～200rpm摇床振荡培养20分钟，将浸染过的子叶外植体置无菌的滤纸上吸去多余的菌液，接种在共培养培养基MS-Jc1上暗培养3天；所述的共培养培养基MS-Jc1包括下述组份：MS基础培养基附加6-BA 3mg/L，IBA 0.01mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7g/L，pH5.8；

(3)外植体的愈伤诱导培养

共培养后的外植体材料用液体抑菌培养基MS-Jc1+500mg/L头孢霉素，洗去多余的菌，于滤纸上吸干材料表面的的液体，接种在不含筛选剂的含300mg/L头孢霉素的固体MS-Jc1抑菌培养基上，在12h光照/12h黑暗、温度为26±2℃条件下进行愈伤诱导培养4周；

(4)抗性芽的筛选

愈伤诱导培养2～4周后，将培养材料继代至筛选培养基中培养，继续培养1～3周后将在子叶基部生长出抗性芽；所述的筛选培养基包括下述组份：MS-Jc1+300mg/L头孢霉素+15～25mg/L硫酸卡那霉素；

(5)抗性芽的生根

抗性芽长至1.5～2cm高时，从愈伤块上切下，转接至生根诱导培养基上诱导生根，所述的生根诱导培养基RIM包括下述组份：1/2MS基础培养基，IBA0.1～0.2mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，头孢霉素100mg/L，硫酸卡那霉素20mg/L和蔗糖1.0％；

(6)转基因植株的分子生物学方法鉴定

取所获得的抗性再生植株的叶片，采用PCR和Southern杂交等分子生物学方法进行转入基因的检测，或进行转入基因的蛋白质产物活性检测。

3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的小油桐基因转化方法，其特征在于：所述的各种植物培养基在制备时，均调pH至5.8，120℃高压灭菌20min，当培养基温度冷至40～50℃时，再添加头孢霉素或硫酸卡那霉素，混匀分装后备用。