[发明专利]携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学发明领域，尤其是涉及一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。

背景技术

我国胃癌年患病率和死亡率为世界平均水平的2倍多，且多数患者确诊时已处于进展期。虽然早期胃癌的治疗效果较为乐观，但对进展期胃癌而言，大多有淋巴和血行转移，相当一部分患者确诊时已失去手术时机，化疗及综合治疗策略虽使其疗效有所改善，但整体疗效欠佳。因此，有必要探索新的治疗方法。

肿瘤基因治疗是目前肿瘤新技术的重要研究热点，基因治疗成功的关键之一在于有效基因载体的选择。目前常用的肿瘤基因治疗导入载体系统有病毒(腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等)和非病毒(脂质体、裸露DNA等)两种。它们各有优点及不足之处，其共同的缺点之一就是缺乏靶向性，载体的非特异性分布使肿瘤组织内的药物浓度不高，难以达到满意疗效。因此，寻找高效具有靶向性的基因治疗载体系统是目前亟待解决的问题。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，它是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。早期研究显示MSCs在机体内可主动募集至炎症或受损部位以修复受损组织，随着研究深入，MSCs在体内可趋向肿瘤病灶处，因此提出MSCs可作为载体携带治疗药物至肿瘤处。骨髓间充质干细胞(Bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等优点。目前多数MSCs基因治疗的研究是以腺病毒为载体将目的基因导入，转染率较低。有报道指出这是因为MSCs表面低表达柯萨奇腺病毒受体，使腺病毒为载体时转染率最高仅20％左右。

NK4基因具有阻断HGF/c-met信号通路抑制HGF诱导的肿瘤细胞侵袭转移及抑制肿瘤血管生成的双重作用。有研究显示NK4基因治疗可明显抑制腹腔种植转移及皮下移植瘤生长，但上述实验均以腺病毒为载体，是瘤体、腹腔局部给药。而临床上进展期胃癌患者多已发生局部或远处转移，瘤体局部给药难度大；静脉系统给药病毒将直接暴露于血循环中，通常被大量粘附在血管内皮细胞和血细胞表面或直接被血液中的抗体中和，再者病毒侵入非肿瘤组织细胞造成病毒被大量损耗而难以到达肿瘤组织。因此，以病毒为载体的局部及静脉给药方式的NK4基因治疗可能难以达到预期效果。

目前尚未见以慢病毒介导NK4基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)靶向治疗胃癌的研究。

发明内容

本发明的第一个目的是建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白(enhancedGreen fluorescent protein，EGFP)融合基因重组慢病毒表达载体的方法，它是从肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)质粒中克隆NK4基因后，采用In-Fusion技术，将其定向克隆至慢病毒表达载体质粒中，构建了NK4-EGFP融合基因重组慢病毒载体质粒(pGC-FU-NK4)，确定正常表达后，将构建的重组的NK4-EGFP慢病毒表达质粒及pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒共转染293T细胞，包装生产NK4过表达慢病毒颗粒(Lenti-NK4)。它解决了以腺病毒为载体将NK4基因导入间充质干细胞转染率较低的问题。

本发明的第二个目的是建立能在体外持续稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞，即携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，它是通过慢病毒介导将NK4基因转染入骨髓间充质干细胞，并确定NK4表达正常。

本发明的第三个目的是携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用，它是将携带NK4的骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内，治疗裸鼠胃癌皮下移植瘤，该方法利用了间充质干细胞对肿瘤的趋向性，因此使提高可NK4基因治疗的靶向性，治疗效果明显，抑瘤率高，实施方法简单，解决了目前NK4基因治疗靶向性差、仅能局部注射给药等缺点。

本发明的第一个目的是这样实现的：

1、目的基因的获取

1.1NK4基因片段a

以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增NK4基因片段a(521bp)。

(1)引物名称及序列：

NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGA CCA AACTCC