[发明专利]一种盐酸克伦特罗磁微粒分离酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及食品安全相关的免疫检测分析技术，特别提供了一种快速检测盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)的磁微粒分离酶联免疫检测方法，适用于尿液、肝脏、肉类和其他组织中的盐酸克伦特罗的定量检测。

背景技术

盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)是一种平喘药。该药物既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂。瘦肉精是一种β2-受体激动剂，20世纪80年代初，美国一家公司开始将其添加到饲料中，增加瘦肉率，但如果作为饲料添加剂，使用剂量是人用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果。它用量大、使用时间长、代谢慢，所以在屠宰前到上市，在猪体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐地积蓄中毒。如果一次摄入量过大，就会产生异常生理反应的中毒现象，因此而被禁用。国内养猪户不顾农业部的规定，为了使猪肉不长肥膘，在饲料中掺入盐酸克伦特罗。猪食用后在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精。

盐酸克伦特罗在胃肠道吸收快，15-20分钟即起作用，2-3小时血浆浓度达峰值，一般健康人食用20μg药效会有所表现，5-10倍的摄入量则会导致中毒，症状为：心率加速、脸色潮红、胸闷、心悸、头痛、发热、寒战。盐酸克伦特罗刺激人体骨骼肌β2-受体后，引起人体四肢、面、颈部骨骼肌振颤。长时间亚治疗剂量摄入，激素残留逐渐蓄积引起慢性毒性作用可使人体产生低敏感现象，即支气管扩张作用明显减弱，作用持续时间缩短，使得哮喘发生率和发病程度增高，同时还可引起内分泌紊乱，导致血液中乳酸、丙酮酸浓度升高，糖尿病人可能因此酸中毒。

食品和饲料中瘦肉精残留量的检测具有重要意义。

磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。

“竞争免疫检测法”是一种多用于检测小分子半抗原的方法，其检测原理是：待测抗原与酶标记的抗原竞争结合少量的固相抗体，通过洗涤去除未结合的抗原，最后加入生物酶催化的显色或发光底物显色。在一定浓度范围内，显色或发光强度与待测抗原含量呈反比。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有灵敏度高、特异性好、适用性广、操作简便和节省检测时间的检测CLB的磁微粒分离酶联免疫检测方法。

所述的CLB磁微粒分离酶联免疫检测方法的试剂组成包括：①磁分离试剂[结合有抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的磁微粒混悬液]；②抗试剂(FITC标记的CLB抗体溶液)；③酶标抗原试剂(偶联有生物酶的CLB溶液)；④清洗液；⑤CLB校准品(含有一定量CLB抗原的溶液)；⑥质控品(含有一定量CLB抗原的溶液)；⑦底物溶液(显色或发光底物溶液)；⑧终止液。

所述的CLB磁微粒分离酶联免疫检测方法的检测方法如下：

(1)样本(食品、饲料等)处理：尿液样本可以直接用于检测。(如果样本很浑浊，需要经过离心或者过滤再进行检测)；内脏组织，肌肉等需粉碎均匀，加入一定比例的10％Na2CO3，加入乙酸乙酯，混合，离心。取上层液留用，下层沉淀再洗一次，将两次离心的上层液合并，60℃氮气吹干，加入纯化水复溶，即可用于检测。

(2)加样和免疫反应：在试管中加入20-200μl样本，然后依次加入20-200μl酶标抗原试剂和20-200μl抗试剂。混匀后，37℃温育5-30分钟；

(3)加磁分离试剂：在试管中加入20-100μl，0.1-10mg/ml的磁分离试剂，混匀后，37℃温育5-30分钟；

(4)洗涤：使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入100-500μl清洗液，去除磁场，震荡30秒使磁微粒充分混悬，再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液。如此重复洗涤2-4次；

(5)加底物溶液：每管加入50-300μl生物酶催化的显色或发光底物。混匀后，37℃温育5-30分钟；

(6)终止显色：每管加入100-300μl终止液，并放在磁分离器上分离10分钟(适用于显色法)；