[发明专利]一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及利用特定的组织裂解液对动物组织包括耳组织、血液或毛发进行快速消化，然后直接用少量的该消化液作为模板，实现PCR扩增。

背景技术

基因组DNA的制备对完成PCR扩增是必不可少的，在动物遗传育种中，PCR扩增是进行基因多态性分析、微卫星分析、基因克隆和测序等研究工作的基础。目前，经常用于DNA提取的动物组织包括耳组织、血液及毛。通常，动物组织样品DNA的提取采用的是传统的酚-氯仿抽提法，但该方法存在步骤繁琐、耗时、耗试剂及安全性差等缺点。如果用该方法大量提取动物组织样品时，上述的缺点将更加突出。一些在此基础改进的方法已有报道，同时也有很多商业化的DNA提取试剂盒，但这些改进的方法及商业试剂盒存在一个共性：提取过程仍需要组织样品的裂解、DNA的乙醇或异丙醇沉淀和70％乙醇清洗DNA这三步，因此在提取大量动物组织样品的DNA时，也同样表现出耗时及费用高的缺点。此外，有报道用整个果蝇的胚胎、幼虫及成虫直接作为模板进行PCR扩增。但用整个动物组织如耳组织、毛囊直接作为模板进行PCR扩增是行不通的。

发明内容

本发明的目的是提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，此方法可以同时处理大量动物组织样品，实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作，快速简化操作步骤，节省成本。

本发明提供一种无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，其中PCR扩增所用的模板为动物组织经组织裂解液消化后的消化液。

所述PCR反应按如下步骤进行：

将动物组织与组织裂解液混合，37～55℃温育25～30min，优选为55℃温育30min，95℃变性5min，取2μl作模板；

PCR反应体系：终浓度为250μM的dNTP，10mMTris-Cl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，2pM上游引物，2pM下游引物，2μl组织消化液，1U Taq DNA聚合酶，用ddH₂O补足至20μl；

PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，61℃复性30s，72℃延伸20～40s，40个循环，然后72℃延伸7min，最后16℃保温。

所述的动物组织选自耳组织、血液或毛发，所述的毛发带有毛囊。

所述组织裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl组成。

所述Tris-Cl的浓度为10mM～100mM，优选10mM，pH8.0；所述的EDTA浓度为1～4mM，优选为2mM，pH8.0，所述的蛋白酶K的浓度为100ug/ml～200ug/ml，优选为200μg/ml；所述的NaCl的浓度为0～0.8M，优选为0.2M。

本发明提供的无需提取动物组织DNA的直接PCR方法，和目前存在的方法和试剂盒相比，该方法简单、快速和节约成本。使用该方法，仅需一步处理动物组织样品，然后直接取2μl处理液为模板完成PCR扩增。此外，该方法特别适用于小组织样品如一根动物毛，因为用目前存在的方法和试剂盒，至少需要5～6根动物毛才能完成DNA的提取。该方法从样品处理到PCR扩增都在PCR仪上完成，在动物中可以实现高通量的以PCR扩增为基础的分子操作如基因分型、微卫星分析、亲子鉴定及基因的克隆和测序。

附图说明

图1所示为不同裂解液处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。图中，1、2、3、4分别表示用裂解液1、裂解液2、裂解液3、裂解液4处理猪耳组织后直接PCR法扩增的产物。5表示没有经任何裂解液处理，直接用耳组织作模板PCR扩增的产物。

图2所示为裂解液中不同EDTA浓度对PCR扩增效率的影响。

图3所示为裂解液中不同EDTA浓度的PCR电泳图。

图4所示为裂解液中不同NaCl浓度对PCR扩增效率的影响。

图5所示为马毛、鸡血、及猪耳组织经优化的组织裂解液处理后直接PCR扩增结果。图中1、3和5表示马毛、鸡血及猪耳组织经优化组织裂解液处理后直接PCR扩增的结果；2、4和6表示用传统酚-氯仿抽提法从马毛、鸡血及猪耳组织提取的DNA为模板PCR扩增的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1