[发明专利]软骨细胞仿生培养模型及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及软骨细胞仿生培养领域，特别是，涉及一种软骨细胞仿生培养模型。

背景技术

对于关节软骨损伤，目前临床手术干预主要包括骨髓刺激方法(钻孔和微骨折)，自体软骨细胞移植，自体骨软骨移植，骨膜或软骨膜移植，以及多种形式生物材料的辅助应用。尽管上述方法都取得了一定程度的成功，但无论单独使用还是组合使用都不足以完全恢复具有多层解剖结构的骨软骨解剖功能，主要表现为新生软骨的力学性能不足，生化组成不良，与周围组织结合不良，直接导致了中远期临床治疗效果下降(see Hunziker EB.Osteoarthritis Cartilage2002；10(6)：432-63；Wang DA，et al.Nat Mater 2007；6(5)：385-92)。

目前软骨损伤的基础研究主要包括体外实验和动物实验两部分。体外研究方法包括平面培养，小球培养(pellet culture)和三维支架材料培养。其中平面培养能够大量增殖软骨细胞(可达1,000倍)，但同时软骨细胞会发生严重的退分化现象(dedifferentiation)(seeGoldring MB.Methods Mol Med 2004；100：37-52)。虽然退分化的软骨细胞有可能在软骨环境中再次分化成软骨细胞，但这还取决于退分化程度和体内局部微环境等诸多因素，增加了实验结果的不稳定性(seeHwang NS，et al.Tissue Eng 2006；12(9)：2695-706)。

小球培养(pellet culture)模仿了软骨形成早期的高细胞密度，低氧以及细胞与细胞之间紧密联结的环境(see Toh WS，et al.StemCells 2007；25(4)：950-60)，是最为广泛使用的体外模型。除了欠缺标准化操作外，两个主要缺陷限制了上述两种模型的广泛使用：

1)不能评价新生软骨与宿主软骨的结合；

2)不能评价周围软骨组织对新植入的软骨细胞和再生的软骨的调控作用。

三维支架材料辅助软骨再生取得了很大进步，但支架的结构和材料的物理化学性能多样性阻碍了它作为标准模型的使用(see Cao T，etal.Cloning Stem Cells 2008；10(1)：1-10)。

发明内容

本发明的目的是提供一个新的体外软骨细胞培养模型，不仅模仿微环境所面临的体内软骨再生环境，还可以评价软骨和骨的形成，以解决现有技术存在的缺陷。

本发明提供一种软骨细胞仿生培养模型，其通过下述方法制备而成：

1)制取中心带有钻孔的表层软骨骨块模型，用PBS清洗，用γ射线消毒；

2)将1.1-1.3％(g/dl，下同)海藻酸钠加至细胞培养板，然后将步骤1得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3)向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步骤3加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗。

其中，所述步骤1中，表层软骨取自于比较大型的动物，如牛、猪马或羊等。

所述步骤2中，将1.2％海藻酸钠加至细胞培养板。

所述步骤3中，向孔中和骨块模型周围加入0.1MCaCl₂溶液。

所述步骤3中，凝固后，在4℃冰箱放置2h。

步骤4中，所述的细胞培养液通过下述步骤制成：向灭菌后的培养瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200μL，整个过程保持无菌环境。

所述PS是双抗，其组成为Penicillin和Streptomycin

本发明还提供制备上述软骨细胞仿生培养模型的方法，包括下述步骤：

1)制取中心带有钻孔的表层软骨骨块模型，用PBS清洗，用γ射线消毒；

2)将1.1％-1.3％海藻酸钠加至细胞培养板，然后将步骤1得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3)向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步骤3加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗。

其中，步骤1中，钻透骨块的目的在于：利用海藻酸钠溶液与氯化钙的凝固作用使骨块固定，海藻酸钠凝胶为透明状，封底可以利用显微镜观察细胞在模型中的生长状况。

步骤2中，加海藻酸钠溶液至细胞培养板中，海藻酸钠溶液不没过模型，主要是为了固定骨块模型。