[发明专利]一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物抗菌肽领域，尤其涉及一种中国家蝇抗菌肽1及其分离纯化方法。

背景技术

抗生素的广泛应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增加，临床抗感染治疗已面临严峻挑战，寻找广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍然是一个十分艰巨的任务。蝇主要生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表带有许多病原菌，能传播多种疾病。但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免疫力，并能产生强效抗菌物质。

生物抗菌肽具有广谱抗菌活性，对G⁺、G^-细菌及真菌都有抗菌活性，特别是对多重耐药菌也有抗菌活性。另外还具有抗肿瘤细胞的作用，与传统抗生素相比，还有促进伤口愈合和免疫调节等作用，是一类具有发展潜力的新型抗菌药。

该领域目前国际上研究较为活跃，找到并能纯化出抗菌谱宽、抗菌活性强的抗菌肽将会有广阔的开发应用前景。

不同抗菌肽分子大小，生物学特征有一定差别，目前肽类的纯化技术较复杂，要分离纯化单一肽类技术难度较大。在抗菌肽的研究中，抗菌肽分离纯化方法的建立是个技术难点，要建立一个结果稳定可靠、操作简单的方法，需要大量工作，反复试验。

发明内容

为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种中国家蝇抗菌肽1，该抗菌肽具有广谱、高效的抗菌活性。

本发明的第二目的在于提供一种从中国家蝇体内分离纯化中国家蝇抗菌肽1的方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种中国家蝇抗菌肽1，包括5个肽段，所述5个肽段的氨基酸序列分别如SEQID NO：1至SEQ ID NO：5所示。

一种中国家蝇抗菌肽1的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)对家蝇进行免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽；

2)将免疫诱导后的家蝇进行组织匀浆，取含有抗菌肽的样品溶液；

3)将含有抗菌肽的样品溶液进行透析浓缩，得到浓缩的样品；

4)将浓缩的样品进行3TGCOO超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品抗菌肽；

5)将半纯品抗菌肽进行HPLC分离纯化，得到色谱纯中国家蝇抗菌肽1。

所述步骤1)具体为：先使家蝇麻醉，然后带有细菌悬液的不锈钢针刺透体壁，再使其复苏，刺伤后在温度28～30℃饲养24h，通过损伤感染免疫诱导，使家蝇产生抗菌肽。

所述细菌悬液为大肠埃希氏菌悬液、铜绿假单胞菌悬液或金黄色葡萄球菌悬液。

所述步骤3)具体为：首先将含有抗菌肽的样品溶液4℃下60000g离心60min，除去沉淀和上层漂浮的脂肪层；再取上清液装入分子量截留值为1500U的透析袋内，包埋于聚乙二醇中，在4℃下透析过液。

所述步骤4)具体为：透析浓缩的样品60000g离心30min，取上清用UFC3TGCOO超滤柱，以60000g离心超滤。

所述步骤5)具体为：样品超滤液采用RT-HPLC半制备柱纯化，半制备柱上样量为1.0ml～2.0ml，流速为1.0ml/min，在214nm检测波长下，当开始出峰时，进行样品的部分收集。保留时间为18.008min时的收集品为色谱纯中国家蝇抗菌肽1

用上述方法制备的中国家蝇抗菌肽1。

本发明所述中国家蝇抗菌肽1是最新发现的一种小分子肽，抗菌肽的活性较强，能非特异性地抗细菌，是一类具有发展潜力的，对多重耐药菌有抵抗作用的新型抗菌药。

本发明所述中国家蝇抗菌肽1分离纯化方法，具有简便易行，稳定性、重复性好等优点，不同批次纯化的抗菌活性用Lowry法测定多肽含量，其蛋白质浓度范围为0.20g～0.25g/L，是一种有实用价值的全新的抗菌肽分离纯化技术。

说明书附图

图1是3TGCOO超滤柱进行超速离心过滤，得到半纯品的中国家蝇抗菌活性组分的RP-HPLC色谱图；

图2是纯化中国家蝇抗菌肽1的RP-HPLC分析柱分析色谱图；

图3是Sephadex G50层析收集的中国家蝇抗菌肽1对铜绿假单胞菌的抗菌活性试验结果图，15(80min～85min)、16(85min～90min)、17(90min～95min)为不同保留时间收集的样本，加样量：20μg蛋白质/纸片；

图4是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段1的质谱图；

图5是中国家蝇抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段2的质谱图；

图6是中国家蝇抗菌肽1Tricine SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。

具体实施方式

实施例1一种中国家蝇抗菌肽1