[发明专利]一种获取古代动物遗传信息的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种古代动物DNA的提取方法和获取古代动物遗传信息的方法。

背景技术

古DNA(ancient DNA，aDNA)是指从已经死亡的古代动物的遗体和遗迹中得到的DNA。过去的十数年间，针对古代动物的分子生物学发展迅猛，人们已经利用动物遗骸进行了大量的DNA提取及研究，并成功获取了大量已灭绝动物的遗传信息，揭示了这些灭绝动物间的系统发生学关系，也通过家养动物遗骸的遗传信息分析获知其驯化、分布和扩散等信息，为人类的发展和迁徙提供了佐证。

总的来讲由于年代久远，在内外环境的影响下，古DNA具有数量少、片段短、受损伤等特点。在保存状态较好的情况下，每毫克古代样品中约含2,000个长约100bp的线粒体DNA分子，比新鲜组织中的含量少六个数量级以上。而保存状态一般的样品中，古代DNA的含量更低，仅为每毫克组织10-40个分子。古DNA已降解成短的片段，一般仅为约50-500bp大小。动物死亡之后，DNA通常被细胞破裂释放的核酸酶降解。特殊条件下，例如，干燥、低温或高盐浓度环境中核酸酶会失活。这样得以保存下来的遗传物质，还将在漫长的历史埋藏中经历缓慢的外界作用，包括温度、湿度、紫外光等物理因素，酸、碱、金属离子、化合物等化学因素以及微生物侵蚀等，这些作用对古DNA造成的降解和损伤都将影响其提取和扩增(表1)。其中碱基水解脱氨基导致的胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶、腺嘌呤脱氨基形成次黄嘌呤是DNA损伤的主要形式。研究发现，DNA样本中腺嘌呤脱氨基生成次黄嘌呤的速率仅为胞嘧啶脱氨基速率的2-3％，因此胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶是DNA损伤的最主要形式。而可扩增的古DNA大都源于线粒体DNA，线粒体DNA拷贝数高，片段较小(脊椎动物约16.5kb)，结构致密(为共价、闭合的双股螺旋)，受酶解及外界因素作用位点少而降解速度相对较慢，因此在古代样本中比核DNA片段更加完整和稳定，常被选为古DNA研究的目标。

古DNA研究中很关键的一个问题就是所获得遗传信息的可靠性。此可靠性是指，用PCR方法从含古DNA的抽提液中扩增所得到的DNA序列是真正的目的DNA，而不是被污染的外源DNA或受损伤的模板DNA。目前外源污染的威胁主要还是存在于对人类遗骸的研究中，因为现代人类的DNA在实验室及博物馆都相当普遍且不能轻易与古代DNA区分开来。而对动物遗骸进行研究时，在操作环境和实验流程都能严格遵循前人成功经验标准的前提下，其真实序列信息获取的最大干扰则是受损伤模板的存在。

表1古代DNA损伤类型一览表(引自Paabo，et al.，2004)

保存在博物馆和研究所里的绝大多数古代材料都已受到了不同程度的污染，去污染是一个必不可少的步骤。常见方法有打磨样品表面、用等离子体处理骨骼样品、用化学试剂去除样品表面的杂质DNA分子、紫外线照射去除污染DNA等，为确保污染的清除，经常同时使用多种去污染手段处理样品。目前，人们也在积极寻找更为简便高效的去除样品污染的方法，本发明中对此环节不作过多阐述。

DNA的常见提取方法包括酚仿抽提法、硅粒法及由硅粒法衍生而来的硅离心柱法(商业化试剂盒提取方法)等，在古DNA研究领域，异丙醇代替乙醇沉淀DNA的方法和硅离心柱法已经被证明能更有效地去除PCR反应抑制物。

由于碱基缺失和碱基修饰类的损伤都会终止PCR反应，而由于碱基脱氨基造成的错配损伤，并不会终止模板的扩增，而是在扩增中引入错误的碱基。所以在所有损伤类型中，错配损伤型DNA模板的存在是获得真实古代DNA序列的最主要障碍之一。

目前，常见的古DNA遗传信息真实性保证的方法主要侧重于对样品的前期处理，由于古DNA在样品中的含量极为稀少，在提取过程中如果不能有效去除样品中含有的抑制物和干扰物，所得DNA片断的扩增效率往往将大打折扣，而一些去除污染的措施可能导致提取效率的降低，从而无法获得所需的古DNA目标序列，此外，在后续的扩增步骤中如果不采取有力的措施排除受损伤DNA序列信息的干扰，也将无法获得所需的遗传信息。

发明内容

本发明目的在于提供一种古代动物DNA的提取方法。

本发明提供的古代动物DNA的提取方法，包括以下步骤：

1)将古代动物样品置于裂解缓冲液中裂解，收集裂解液；

2)向上述步骤1)中得到的裂解液中加入与所述裂解液等体积的助沉缓冲液进行处理，离心得到上清液；所述助沉缓冲液的溶剂是水，溶质是醋酸钾和氯化锂，其中醋酸钾的终浓度为1.40-1.45mol/L，氯化锂的终浓度为4.25-4.30mol/L；