[发明专利]一种猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因及制备方法与应用

权利要求书

1.一种分离克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的部分核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离克隆的分泌核酸酶SsnA基因，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA，其包含序列表SEQ ID NO：1所述的基因，其保藏号为CCTCC NO：M2010155。

4.一种猪链球菌2型的抗原蛋白，它是由序列表SEQ ID NO：1所述的基因转化大肠杆菌，得到保藏号为CCTCC NO.M2010155的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/PET28a-SsnA所表达的。

5.一种猪链球菌2型抗原蛋白的制备方法，其步骤包括：

1)设计引物对，通过PCR方法，从猪链球菌2型中克隆得到一种分泌核酸酶SsnA基因，它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

2)将猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA基因插入到原核表达载体pET-28a(+)的BamHI和XhoI多克隆位点，得到中间质粒pET28a-SsnA；

3)将步骤2)所述的中间质粒pET28a-SsnA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经抗性筛选得到阳性重组大肠杆菌BL21/PET28a-SsnA，其保藏号为CCTCC NO：M2010155；

4)将步骤3)所述的重组大肠杆菌在LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导，western blot分析，得到具有免疫学活性的猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白；

5)将步骤4)中所得到猪链球菌2型分泌核酸酶SsnA蛋白包被ELISA酶标板，得到ELISA抗原酶标板，按照ELISA方法检测待检血清，判定结果；

其他核心试剂还包括如下组分：

包被液为25mmol/L碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加双蒸水至1000mL，pH9.6；

20倍浓缩洗涤液：NaCl160g，KCl4g，Na₂HPO₄·12H₂O 58g，KH₂PO₄4g，Tween-20 10ml加双蒸水定容至1000ml；

封闭液：浓度为5g脱脂乳溶于100mL洗涤液中；

底物液：底物液A：浓度为0.006％的H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500ml配成浓度为0.1M，pH为5.0的磷酸盐柠檬酸缓冲液，然后加联苯二胺10mg；

终止液：浓度为40％的氢氟酸625μL，加双蒸水定容至100mL；

其中步骤1)所述的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：P1 5’-GTGGGATCCACTGAAGTGGCGATA-3’，

反向引物：P2 5’-TGGCTCGAGCATCTGGTGTGACAT-3’。

6.权利要求1或2所述的基因在制备猪链球菌2型的抗原蛋白中的应用。

7.权利要求3所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型鉴别诊断试剂盒中的应用。

8.权利要求4所述的抗原蛋白在制备猪链球菌2型鉴别诊断试剂盒中的应用。