[发明专利]一种白藜芦醇的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用酿酒酵母发酵葡萄酒渣制备白藜芦醇的方法，属生物工程领域。

(二)背景技术

每年世界葡萄总产量中80％用于酿酒，由葡萄的世界产量可知，葡萄酒的世界年产量也是个庞大的数字。中国的葡萄酒产业发展历史较短，但随着中国经济的腾飞，其葡萄酒生产的发展速度也是相当惊人。据统计，从1996年至2004年，中国葡萄酒的产量从17刀吨增长到40万吨，年平均增长率为11.3％。据报道，2010年我国葡萄酒年产量有望达到80万吨。由于葡萄酒的大量生产和消费，同时也产生了大量的葡萄酿酒后的副产品——葡萄酒渣(葡萄皮渣、籽、梗)。一些发达国家如法国、意大利、西班牙等这些葡萄酒生产大国，其葡萄废弃物的70％以上均能得到很好的利用，但我国常年来由于葡萄酒生产季节性强、生产集中，导致这些废弃物往往来不及处理就被随意抛弃或作为废料处理掉，这不仅影响环境卫生，而且也是对资源的极度浪费。研究表明，酿酒后的葡萄废弃物中含有大量以植物多酚为主的生物活性物质，如白藜芦醇、酚酸、黄酮、原花青素等，这些物质具有非常重要的生理功能特性，因此有极大的开发前景。

本发明采用酿酒酵母发酵葡萄酒渣，经过酒精提取、精致后制备白藜芦醇，本产品可以广泛应用于保健食品中。白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗血小板聚集、雌激素样、抗炎等生理作用，因此，开发和利用白藜芦醇不仅为葡萄皮渣的综合利用开辟了新途径，还可带来巨大的经济效益和社会效益，具有广阔的开发前景。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种白藜芦醇的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为质量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：

1.酿酒酵母的选择及培养基的制备

本发明选择的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购置于中国工业微生物菌种包藏中心，编号为31482，培养基为：5°Bé麦芽汁。

2.发酵菌株的诱变及驯化过程

菌种的诱变采用紫外线照射原生质体的方法。取经0.6u/mL青霉素预处理1.5h的菌液5mL于离心管中，4000r/min离心，弃上清液，用高渗液洗涤菌体2次，配成高渗菌悬液，加入1.0rag/mL溶菌酶于34℃保温15h，离心洗涤，用高渗液悬浮，制成原生质体高渗悬浮液。

采用15W紫外灯，距离30cm，照射0～30s，边搅拌边照射，力求使菌体均匀吸收紫外线光波，以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无菌试管中，并立即浸入冰水中1h，在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。

采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，从培养至对数生长期的平板上随机挑取若干个单菌落接种到试管琼脂斜面中，在28℃培养5d后，挑取菌体生长相对较好的试管中的菌体用摇瓶进行复筛。

复筛：将菌体生长相对较好的试管中的菌体分别接种到盛有200mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃，150转/分钟条件下培养3d，检测葡萄糖苷酶活，选择酶活500u以上的菌种均可作为发酵葡萄酒渣出发菌株。

葡萄糖苷酶活检测方法：

β一葡萄糖苷酶活力国际单位定义为：以p-NPG(对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷)为底物，在一定的分析条件下，每min释放1nmol对一硝基苯酚所需要的酶量为一个活力单位。

在一定条件，β-葡萄糖苷酶能够水解对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷中的糖苷键，生成对-硝基苯酚，在碱性条件下显黄色，可以通过比色法定量测定该黄色物质的含量，进而计算出β-葡萄糖苷酶的活力。准确称量对-硝基苯酚139.0mg，用蒸馏水定容至1000ml。分别吸取该溶液1，2，3，4，5，6mL至100mL容量瓶中，用1mol/L Na₂CO₃溶液定容后混匀，使每mL稀释液分别含有对-硝基苯酚0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06μmol。以蒸馏水为空白，在400nm吸收波长下测定其吸光值，以对一硝基苯酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。