[发明专利]一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素的单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种能同时检测金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素(staphylococcal enterotoxins，简称SEA和SEB)的毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于首先将适量的SEA和SEB等量混合，然后免疫雌性BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，运用间接ELISA(Enzyme linked immunosorbentassay，简称ELISA)筛选出能同时针对SEA和SEB的杂交瘤细胞株，然后用小鼠体内生产腹水的方法制备得到能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体。

2.按权利要求1所述的一种能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的SEA和SEB混合免疫BALB/c小鼠的过程为：小鼠注射抗原前一周，在小鼠背部皮下注射1mg卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平，将适量的的SEA和SEB等量混合，随后分别于不同间隔时间各注射抗原一次，每只每次免疫剂量约200～400μL，首次免疫时，先将抗原与等体积的完全福氏佐剂乳化均匀，以后各次均将抗原与等体积不完全弗氏佐剂完全乳化均匀，然后采用不同免疫程序进行动物免疫。

3.按权利要求1或2所述的一种能同时检测SEA和SEB的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的运用间接ELISA法筛选出能同时针对SEA和SEB的杂交瘤细胞株的过程为：

(1)包被：用CBS(Carbonate buffer solution，简称CBS)将SEA和SEB稀释到1μg/mL，分别加入到各自的96孔微孔板中，每孔100μL，4℃过夜，待恢复至室温后，倾去包被液，PBST(Phosphate buffered saline Tween-20，简称PBST)满孔洗涤三次，每次5min，扣干；

(2)封阻：每孔加5％的脱脂牛奶(溶于PBST)200μL作为封阻液，置于37℃保温保湿2h，恢复至室温，倾去封阻液，洗涤同上；

(3)抗原抗体反应：每孔加入细胞培养上清液和以PBST代替上清液作为空白对照，每孔100μL，37℃保温保湿1h，洗涤同上；

(4)酶标二抗与抗原抗体复合物反应：每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(酶标二抗，1∶4000稀释)，37℃保温保湿1h，PBST洗涤5次，每次5min，扣干；

(5)底物显色反应：每孔加底物液100μL(40mg邻苯二胺溶于100mL底物缓冲液，再加入150μL H₂O₂，现配现用)后，37℃保温保湿，避光反应30min后，每孔加入50μL 2mol/LH₂SO₄终止反应，5min后，以空白对照调零，于492nm测吸光值，以P/N≥2.1判为阳性(P、N分别代表阳性上清液和阴性上清液的492nm处的吸光值)，从而筛选对SEA和SEB都呈阳性的孔。