[发明专利]一种体外检测标记物及其制备方法以及其所制成的试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测领域，特别是涉及一种体外检测标记物及其制备方法以及其所制成的试纸条。

背景技术

近几十年来，世界范围内的过敏人群日益增多。过敏这一概念通常是指I型超敏反应(速发型过敏反应)，通常在接触过敏原30分钟后引发症状。引起I型超敏反应的过敏原大多是来自自然环境的蛋白质，如植物花粉、动物皮毛、食物、尘螨和昆虫毒液。I型超敏反应的显著特点是过敏原与特异性免疫球蛋白E相结合(sIgE)，因此检测sIgE成为目前过敏诊断的重要手段。

免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

近年来，提供可靠、即时的检测结果是检验医学发展的方向之一。这种需求促使各种能在患者身边进行的医学检测(POCT)产品不断推出。20世纪90年代初发展起来的金标记免疫测定技术，已在临床上得到了广泛的应用，涉及的检测项目包括感染性疾病抗原、抗体，肿瘤标志物，激素和药物的检测。

胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合，从而对诊断检测产生一定影响。

由此可见，上述现有的金标记免疫测定技术在使用仍存在缺陷，而亟待加以进一步改进。如何能创设一种同样能用于快速诊断，且标记物的物理性能稳定，不需要特殊的反应条件，从而降低实验操作要求，简化操作步骤的新的体外检测标记物及其制备方法以及其所制成的试纸条，实属当前重要研究课题之一，亦成为当前业界极需改进的目标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种体外检测标记物的制备方法，使其制备出可替代免疫金颗粒的聚苯乙烯微球，用来标记抗体，完成体外快速诊断。

为解决上述技术问题，本发明一种体外检测标记物的制备方法，主要包括以下步骤：A.将抗体溶于去离子水中，使其浓度达到1mM；B.将直径0.3-0.5um的聚苯乙烯微球储存液震荡后，取出2ul微球溶液离心；C.除去上清后加缓冲液，并震荡；D.将步骤A的产物1∶10稀释，并取2ul置于步骤C的离心管中；E.加入2.5ul 10mg/ml的EDC，并在震荡混合均匀后孵育；F.加入表面活性剂并离心；G.除去上清，将沉淀溶于缓冲液，震荡、显微镜计数、保存。

作为本发明的一种改进，所述的离心使用Eppendorf离心管，条件为8000g-10000g转速离心1-2min。

所述的步骤C中加入的缓冲液为50ul 100mM的MES，并控制pH值为4.5。

所述的震荡均为剧烈震荡20s。

所述的步骤E孵育条件为室温暗室孵育30min。

所述的步骤F包括：先加入1.0ml 0.02％的表面活性剂Tween-20并离心；再除去上清，加入1.0ml 0.1％的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心。

所述的步骤F包括：先加入1.0ml 0.1％的阴离子表面活性剂SDS、振荡、离心；再除去上清，加入1.0ml 0.02％的表面活性剂Tween-20并离心。

所述的步骤G的缓冲液为100mM pH值为8.0的Tris溶液，保存条件为4℃。

本发明还提供了根据上述制备方法制成的体外检测标记物，使其物理性能更加稳定，实验操作更加简单。

本发明也提供了由上述体外检测标记物制成的试纸条，使其可用于体外快速诊断，且不需要特殊反应条件，从而降低实验操作要求，简化操作步骤，克服现有金标记免疫测定技术的不足与缺陷。

为解决上述技术问题，本发明试纸条，包括底板，以及依次固定在底板上的样品垫、标记区、NC膜和吸水滤纸，其中，标记区分布有上述的体外检测标记物。

采用这样的设计后，本发明具有以下优点：

1、利用带有羧基并染有颜色的聚苯乙烯微球代替免疫层析中用到的胶体金颗粒标记抗体，能从血清、血浆或全血中检测出是否含有针对过敏原的特异性IgE抗体，检测速度快；

2、聚苯乙烯微球与抗体(或抗原)以化学法连接，在连接的同时并不影响抗体(抗原)的免疫学活性；